JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Resumo

No campo da medicina regenerativa e aplicações terapêuticas, a pesquisa com células-tronco está ganhando força rapidamente. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), que estão presentes nos dentes decíduos e permanentes, surgiram como uma fonte vital de células-tronco devido à sua acessibilidade, adaptabilidade e capacidade de diferenciação inata. As DPSCs oferecem um reservatório abundante e prontamente disponível de células-tronco mesenquimais, apresentando versatilidade e potencial impressionantes, principalmente para fins regenerativos. Apesar de sua promessa, o principal obstáculo está em isolar e caracterizar efetivamente as DPSCs, dada sua representação como uma fração minúscula dentro das células da polpa dentária. Igualmente crucial é a preservação adequada desse inestimável recurso celular. Os dois métodos predominantes para isolamento de DPSC são a digestão enzimática (ED) e o crescimento de explantes de tecido (OG), muitas vezes chamados de crescimento espontâneo. Este protocolo concentra-se principalmente na abordagem de digestão enzimática para isolamento de DPSC, detalhando intrincadamente as etapas que abrangem extração, processamento em laboratório e preservação celular. Além da extração e preservação, o protocolo investiga as proezas de diferenciação das DPSCs. Especificamente, descreve os procedimentos empregados para induzir essas células-tronco a se diferenciarem em adipócitos, osteoblastos e condrócitos, mostrando seus atributos multipotentes. A utilização subsequente de técnicas de coloração colorimétrica facilita a visualização precisa e a confirmação da diferenciação bem-sucedida, validando assim o calibre e a funcionalidade das DPSCs isoladas. Este protocolo abrangente funciona como um modelo que abrange todo o espectro de extração, cultivo, preservação e caracterização de células-tronco da polpa dentária. Ele ressalta o potencial substancial abrigado pelas DPSCs, impulsionando a exploração de células-tronco e prometendo futuros avanços regenerativos e terapêuticos.

Introdução

A pesquisa com células-tronco floresceu na ciência biomédica devido às suas aplicações promissoras em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), derivadas do tecido pulpar de dentes decíduos e permanentes humanos, têm atraído interesse significativo como fonte de células-tronco devido à sua pronta disponibilidade e capacidade multipotente 1,2. Essas células têm o potencial de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipócitos, osteoblastos e condrócitos, conforme confirmado por vários estudos3.

Nas últimas décadas, a pesquisa e as aplicações terapêuticas de células-tronco aumentaram. O potencial expansivo das células-tronco exige a diversificação das fontes de onde são obtidas. Vários fatores influenciam a eficiência, viabilidade e estaminalidade das células escolhidas. Apesar da existência de vários reservatórios de células-tronco conhecidos, como medula óssea e tecidos adiposos, os procedimentos invasivos, a morbidade do local e as preocupações éticas ligadas a essas fontes muitas vezes limitam sua exploração 4,5. Dentre as várias fontes de células-tronco, as células-tronco dentárias têm ganhado atenção devido à sua fácil acessibilidade, alta plasticidade e diversas aplicações potenciais. As células-tronco da polpa dentária humana, em particular, têm sido extensivamente pesquisadas por suas perspectivas terapêuticas6. Os dentes, comumente descartados como resíduos médicos, contêm uma grande quantidade de células-tronco mesenquimais7. Proteger esse valioso pool de células-tronco requer esforços coletivos de pacientes, dentistas e médicos para garantir que esses recursos não sejam desperdiçados, tornando cada célula-tronco da polpa dentária disponível para futuras necessidades regenerativas.

As células-tronco derivadas da polpa dentária, como células-tronco da polpa dentária adulta humana (DPSCs) e células-tronco de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED), estão localizadas no nicho perivascular da polpa dentária. Acredita-se que essas células se originem de células da crista neural craniana e exibam marcadores precoces para células-tronco mesenquimais (MSCs) e células-tronco neuroectodérmicas. DPSCs e SHEDs demonstraram multipotência e capacidade de regenerar diversos tipos de tecidos8.

As fontes potenciais de células-tronco dentárias abrangem dentes decíduos e permanentes saudáveis. As células-tronco constituem apenas cerca de 1% da população total de células na polpa, destacando a importância de técnicas eficazes de isolamento e expansão9. Consequentemente, a extração e expansão dessas células-tronco são etapas fundamentais no isolamento do DPSC10. Os dentes extraídos ou esfoliados precisam ser armazenados em um meio de transporte rico em nutrientes, como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com Hanks (HBSS).

A obtenção da polpa dentária pode ser obtida por meio de vários métodos, dependendo do tipo de dente 7,11. Para dentes decíduos com raízes reabsorvidas, a extração pode ser realizada através do ápice radicular. Da mesma forma, brochas farpadas estéreis podem ser usadas para obter polpa de dentes permanentes com ápice aberto imaturo. Nos casos de dentes permanentes com raízes totalmente desenvolvidas, o acesso à câmara pulpar envolve a separação da coroa dentária da raiz. Isso é feito cortando o dente usando um disco de diamante na junção cemento-esmalte. Essa incisão expõe a câmara pulpar, possibilitando a recuperação do tecido pulpar 12,13,14.

As células-tronco da polpa dentária (DPSCs) podem ser isoladas por digestão enzimática (DE) ou crescimento a partir de explantes teciduais (GO), também conhecido como crescimento espontâneo. O método DE emprega enzimas, principalmente colagenase I e dispase, para quebrar o tecido em suspensões unicelulares15,16. O método OG, mais simples e rápido, consiste em cortar os fragmentos de polpa e colocá-los diretamente em uma placa de cultura, permitindo que as células cresçam a partir dos explantes de tecido17. Os pesquisadores utilizaram e compararam ambas as técnicas para avaliar as taxas de proliferação celular, preservação de propriedades de células-tronco isoladas, diferenciação e expressão de marcadores de superfície18. O estabelecimento e padronização de protocolos para aquisição de CPDP com alta eficiência e estaminalidade pode abrir caminho para terapias eficazes e seguras19. Este protocolo abrange a extração de DPSCs usando digestão enzimática, processamento em laboratório, preservação e diferenciação celular com coloração colorimétrica para adipogênese, osteogênese e condrogênese.

O protocolo descrito neste artigo apresenta um procedimento passo a passo, iniciando-se com o isolamento inicial da polpa dentária do dente, seguido de cultura e manutenção das DPSCs em laboratório, e concluindo com sua caracterização usando marcadores específicos de células-tronco (Figura 1). As técnicas de indução dessas células-tronco em diferentes linhagens celulares, destacando sua multipotência, também são descritas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa com seres humanos (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). O uso de dentes extraídos foi realizado seguindo padrões éticos para garantir a integridade, dignidade e direitos dos participantes. Os participantes selecionados para este estudo foram indivíduos saudáveis com menos de 30 anos de idade que necessitaram de exodontia para tratamento ortodôntico. Aqueles com cárie dentária extensa ou periodontite grave foram excluídos do estudo. Foram coletados dentes decíduos de crianças que necessitaram da extração de dentes retidos. O consentimento informado por escrito também foi obtido dos sujeitos envolvidos neste estudo.

1. Extração e transporte de dentes

  1. Coleta de dentes decíduos e permanentes
    1. Explique aos participantes o objetivo do procedimento e o potencial uso dos dentes extraídos para fins de pesquisa.
    2. Realize a extração dos dentes sob anestesia local, administrando um agente anestésico nas proximidades do dente a ser extraído. Especificamente, 1,75 mL de lidocaína misturada com epinefrina (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:200.000 foi injetada para este estudo. A seleção de dentes que não apresentem cárie dentária grave ou periodontite é preferível20,21.
  2. Transporte dos dentes extraídos
    NOTA: Recomenda-se trabalhar em condições assépticas para evitar contaminação. Isso inclui o uso de equipamentos de proteção individual, como luvas e jaleco, e o trabalho em um ambiente estéril, como uma capa de fluxo laminar de risco biológico.
    1. Depois que o dente for extraído, enxágue-o com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue e outros detritos. Usando uma pinça estéril e bisturi, remova cuidadosamente quaisquer restos de tecido mole da superfície do dente (Figura 2A).
    2. Mergulhe o dente em uma solução desinfetante, como etanol a 70%, por 10 s. Após a desinfecção, enxágue o dente com PBS estéril para remover qualquer desinfetante residual.
    3. Coloque o dente em um recipiente estéril contendo o meio de transporte.
      NOTA: O meio de transporte consistia em Alpha-MEM, um meio de cultura comercial suplementado com antibióticos: 100 U / mL de penicilina / estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Este meio forneceu nutrientes essenciais às células dentro do dente extraído, garantindo sua sobrevivência até o processamento laboratorial. Os antibióticos serviram para inibir o crescimento bacteriano.
    4. Mantenha uma temperatura de 4 °C durante o transporte para retardar as atividades metabólicas celulares e retardar a morte celular. Transporte o dente para o laboratório para as próximas etapas, incluindo o processamento e isolamento das células-tronco da polpa dentária.

2. Coleta de tecido pulpar

  1. Prenda o dente usando uma pinça dentária para garantir que ele permaneça no lugar durante o procedimento. Use um disco diamantado para cortar o dente em uma peça de mão odontológica (consulte a Tabela de Materiais) conectada a um refrigerante de água (Figura 2B).
    NOTA: O objetivo é expor a câmara pulpar sem causar danos desnecessários ao tecido pulpar interno.
  2. Utilize uma escavadeira odontológica (consulte a Tabela de Materiais) para remover o tecido pulpar. Este instrumento permite a extração da polpa sem causar danos, preservando assim a viabilidade das células-tronco da polpa dentária (Figura 2C).
  3. Coloque o tecido obtido em uma placa de Petri de vidro. Lave o tecido pulpar com solução salina tamponada com fosfato.

3. Digestão do tecido pulpar e isolamento celular

  1. Trituração e digestão de tecidos
    1. Com uma lâmina cirúrgica estéril, pique cuidadosamente o tecido pulpar em pequenos fragmentos (Figura 2D) e coloque-o em um mini moedor de lenços de papel com PBS para obter uma mistura finamente homogeneizada. Esse processo aumenta a área de superfície do tecido, facilitando a ação enzimática mais eficiente durante a digestão.
    2. Transfira os fragmentos de tecido homogêneo picados para um tubo de 15 mL e digerir enzimaticamente utilizando uma mistura de 3 mg / mL de colagenase tipo I e 4 mg / mL de dispase (ver Tabela de Materiais). Essas enzimas foram dissolvidas na Solução Saleira Balanceada de Hank (HBSS) para atingir as concentrações desejadas.
    3. Incubar o tecido pulpar na mistura enzimática (etapa 3.1.2) durante cerca de 2 h a 37 °C. Após a incubação, neutralizar as enzimas e recolher as células por centrifugação (passo 3.2.1) para posterior cultura.
  2. Centrifugação e ressuspensão
    1. Após a incubação, transfira o tecido digerido para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células. Esta etapa separa as células dos fragmentos de tecido e enzimas não digeridos restantes. Descarte cuidadosamente o meio sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet celular no fundo do tubo.
    2. Ressuspenda o pellet celular em um meio de cultura fresco. Este meio fornece os nutrientes e o ambiente necessários para que as células isoladas sobrevivam e proliferem.

4. Cultura celular

  1. Plaqueamento e incubação de células
    1. Transferir cuidadosamente as células ressuspensas para um balão de cultura de 25 cm².
      NOTA: Todo o material de uma única polpa é transferido para um único balão de cultura de2 células de 25 cm. Um volume de mídia de 5-7 mL garante cobertura suficiente e disponibilidade de nutrientes para as células. Certifique-se de que o meio de cultura para DPSCs seja o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% -20% de soro fetal bovino (FBS) (consulte a Tabela de Materiais) para fornecer os fatores de crescimento necessários. Além disso, suplemente o meio com penicilina / estreptomicina a 1% para evitar a contaminação bacteriana. Certifique-se de que as células estejam uniformemente distribuídas por todo o frasco para promover um crescimento homogêneo.
    2. Incubar o balão a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2.
  2. Mudança média e monitoramento da confluência
    1. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias para fornecer nutrientes frescos e remover resíduos metabólicos. Para fazer isso, aspire cuidadosamente o meio antigo usando uma pipeta sorológica estéril e substitua-o por um meio novo.
    2. Monitore regularmente a cultura de células ao microscópio para rastrear o crescimento das células e verificar se há sinais de contaminação.
    3. Continue esse processo até que as células atinjam 80% -90% de confluência, o ponto em que as células cobrem a maior parte da área de superfície do frasco, mas não estão excessivamente lotadas.
  3. Tripsinização celular e passagem ou congelamento
    1. Quando as células atingirem 80% -90% de confluência, remova o meio de cultura e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio residual e as células não aderentes.
    2. Adicione uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% ao frasco para separar as células da superfície do frasco. Incubar durante 2-5 min a 37 °C até as células levantarem.
    3. Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura e, em seguida, pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir o descolamento celular completo.
    4. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células.
    5. Ressuspenda as células em um meio de cultura fresco e coloque-as novamente em placas (passagem) para crescimento adicional ou congele-as para uso futuro. Ao congelar, use um meio de congelamento que contenha um crioprotetor, como o DMSO, para proteger as células contra danos durante o congelamento.

5. Caracterização das DPSCs

  1. Análise de citometria de fluxo
    1. Para confirmar a natureza das células-tronco mesenquimais das células isoladas, realize a análise de citometria de fluxo22,23. Inicialmente, tripsinize e colete células conforme descrito na etapa 4.3.
    2. Determine a viabilidade celular pela técnica de exclusão do corante tripano. Realize a análise usando um analisador de viabilidade celular (consulte a Tabela de Materiais) durante a2ª e8ª passagens. Realize a análise fenotípica por meio de um citômetro de fluxo durante a3ª e7ª passagens.
    3. Após a incubação, lave as células em um tampão de citometria de fluxo para remover o excesso de anticorpos e analise as células usando um citômetro de fluxo.
      NOTA: O tampão de citometria de fluxo é composto por solução salina tamponada com fosfato (1x PBS), 1%-2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de azida sódica (NaN3). O FBS ou BSA bloqueia a ligação não específica de anticorpos, enquanto a azida de sódio atua como conservante. Uma alta porcentagem de células deve expressar os marcadores de células-tronco mesenquimais e não possui os marcadores hematopoiéticos, confirmando sua identidade como DPSCs24.
    4. Separe as DPSCs e comode-as com anticorpos de imunofluorescência para análise de citometria de fluxo.
      NOTA: A seleção de marcadores para análise por citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais (CTMs) é baseada no consenso estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT), que afirma que as CTMs devem expressar CD105, CD73 e CD90, e não ter a expressão de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA classe II25. Esses marcadores são comumente utilizados em estudos que investigam células-tronco da polpa dentária26. As concentrações de anticorpos para coloração podem variar dependendo do anticorpo específico usado, e recomenda-se seguir as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para diluições de anticorpos e condições de incubação25.
    5. Estabelecer os critérios de classificação 27,28 para a expressão dos marcadores DC mencionados: menos de 10%, sem expressão; entre 11% e 40%, baixa expressão; uma variação de 41% a 70%, expressão moderada; acima de 71%, alta expressão.
    6. Além disso, confirme a ausência de marcadores hematopoiéticos incubando uma alíquota celular separada com anticorpos contra CD34 e CD45.

6. Diferenciação de várias linhagens

NOTA: As etapas a seguir descrevem protocolos para diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica de células-tronco dentárias. Comece semeando culturas a uma densidade de 1 x 10,5 células por poço em uma placa de cultura de tecidos revestida com fibronectina com meio completo (CM). Monitore o crescimento celular até que 80% -90% de confluência seja alcançada antes de iniciar o protocolo de diferenciação desejado. Para avaliar o potencial de diferenciação multilinhagem das DPSCs, inicie o processo de diferenciação em direção a osteoblastos, adipócitos e condrócitos semeando células em placas de 24 poços e cultivando-as em meios de diferenciação apropriados.

  1. Diferenciação osteogênica
    1. Inicie cultivando DPSCs em um meio de crescimento regular sob condições padrão até que atinjam 70% -80% de confluência.
    2. Remova o meio de crescimento das células e, em seguida, lave as células uma vez com 1x PBS. Adicione o Meio de Diferenciação Osteogênica (ODM) às células.
      NOTA: O ODM consiste em meio essencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado com 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona (ver Tabela de Materiais).
    3. Incubar as células no meio osteogênico a 37 ° C com 5% de CO2. Troque o meio osteogênico a cada 2-3 dias.
      NOTA: Após 14 a 21 dias, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a osteoblastos. Isso pode ser confirmado verificando se há um aumento na expressão de marcadores específicos para osteoblastos, como a fosfatase alcalina, ou usando técnicas de coloração para detectar matriz mineralizada, como a coloração com vermelho de alizarina S.
    4. Fixe as células incubando-as com etanol gelado a 70% por 1 h a -20 °C.
    5. Manchar as células fixas com solução de coloração 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) à temperatura ambiente no escuro por 10-15 min. Visualize a coloração ao microscópio para confirmar a diferenciação osteogênica (Figura 3). Confirmar a diferenciação colorando as células com Vermelho de Alizarina S, que identifica depósitos de cálcio indicativos de mineralização29,30.
  2. Diferenciação adipogênica
    1. Conforme detalhado na seção anterior, cultive DPSCs em condições padrão em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
    2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação adipogênica. Este meio geralmente consiste em DMEM, 10% FBS, 10 μg / mL de insulina, 1 μM de dexametasona, 200 μM de indometacina e 0,5 mM de IBMX (ver Tabela de Materiais).
    3. Troque o meio de diferenciação a cada 3-4 dias. Após cerca de 3 semanas, lave as DPSCs diferenciadas com PBS e fixe-as com paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min em temperatura ambiente.
    4. Pinte as células fixadas com Oil Red O (consulte a Tabela de Materiais) para visualizar o acúmulo de gotículas lipídicas (Figura 4). Para confirmar ainda mais a diferenciação adipogênica, realize a análise da expressão gênica de marcadores adipogênicos, como o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e adiponectina31,32.
  3. Diferenciação condrogênica
    1. Culturas de DPSCs mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C são usadas para diferenciação condrogênica. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
    2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação condrogênica, que normalmente contém meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com alto teor de glicose, 1% de ITS, dexametasona 100 nM, 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL de prolina e 10 ng/mL de fator de crescimento transformador-beta 3 (TGF-β3) (ver Tabela de Materiais).
    3. Mantenha as células no meio de diferenciação condrogênica, trocando o meio a cada 2-3 dias. Após cerca de três semanas, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a condrócitos.
    4. Fixe as células incubando-as com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente. Após a fixação, core as células com Azul de Alcian (ver Tabela de Materiais) e visualize-as ao microscópio para confirmar a diferenciação condrogênica (Figura 5).
    5. Confirmar a diferenciação de DPSCs em condrócitos usando técnicas como coloração Alcian Blue para proteoglicanos ou análise da expressão gênica de marcadores condrogênicos como agrecan, SOX9 e colágeno tipo II33,34.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

A execução bem-sucedida do protocolo delineado produziu células-tronco pulpares dentárias (DPSCs) capazes de diferenciação de múltiplas linhagens, demonstrando sua multipotência.

Ensaios de viabilidade
A viabilidade dos DPSCs foi avaliada usando um ensaio de exclusão de Trypan Blue em vários momentos. Os resultados mostram uma viabilidade consistentemente alta (maior que 95%) ao longo do período de cultivo, demonstrando a robustez de nosso protocolo de isolamento...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O protocolo descreve o isolamento, cultura e caracterização de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) de dentes decíduos e permanentes humanos. Inclui uma descrição do armazenamento e proliferação dessas células, bem como a avaliação de seu potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos, adipócitos e condrócitos35.

Chen et al.36 demonstraram que as células-tronco da polpa dentária (DPSCs) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Mathew Mazhavancheril, Diretor e Chefe do Centro de Pesquisa Pushpagiri em Thiruvalla, por seu apoio na documentação dos procedimentos no Centro de Pesquisa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

Referências

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Palavras chave C lulas tronco da polpa dent riaDPSCsDentes dec duosDentes permanentesMedicina regenerativaC lulas tronco mesenquimaisDigest o enzim ticaCrescimentoAdip citosOsteoblastosCondr citos MultipotentesDiferencia oIsolamento CelularCultura CelularPreserva o Celular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados