Isolamento, Cultura e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária de Dentes Humanos Decíduos e Permanentes

Resumo

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Resumo

No campo da medicina regenerativa e aplicações terapêuticas, a pesquisa com células-tronco está ganhando força rapidamente. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), que estão presentes nos dentes decíduos e permanentes, surgiram como uma fonte vital de células-tronco devido à sua acessibilidade, adaptabilidade e capacidade de diferenciação inata. As DPSCs oferecem um reservatório abundante e prontamente disponível de células-tronco mesenquimais, apresentando versatilidade e potencial impressionantes, principalmente para fins regenerativos. Apesar de sua promessa, o principal obstáculo está em isolar e caracterizar efetivamente as DPSCs, dada sua representação como uma fração minúscula dentro das células da polpa dentária. Igualmente crucial é a preservação adequada desse inestimável recurso celular. Os dois métodos predominantes para isolamento de DPSC são a digestão enzimática (ED) e o crescimento de explantes de tecido (OG), muitas vezes chamados de crescimento espontâneo. Este protocolo concentra-se principalmente na abordagem de digestão enzimática para isolamento de DPSC, detalhando intrincadamente as etapas que abrangem extração, processamento em laboratório e preservação celular. Além da extração e preservação, o protocolo investiga as proezas de diferenciação das DPSCs. Especificamente, descreve os procedimentos empregados para induzir essas células-tronco a se diferenciarem em adipócitos, osteoblastos e condrócitos, mostrando seus atributos multipotentes. A utilização subsequente de técnicas de coloração colorimétrica facilita a visualização precisa e a confirmação da diferenciação bem-sucedida, validando assim o calibre e a funcionalidade das DPSCs isoladas. Este protocolo abrangente funciona como um modelo que abrange todo o espectro de extração, cultivo, preservação e caracterização de células-tronco da polpa dentária. Ele ressalta o potencial substancial abrigado pelas DPSCs, impulsionando a exploração de células-tronco e prometendo futuros avanços regenerativos e terapêuticos.

Introdução

A pesquisa com células-tronco floresceu na ciência biomédica devido às suas aplicações promissoras em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), derivadas do tecido pulpar de dentes decíduos e permanentes humanos, têm atraído interesse significativo como fonte de células-tronco devido à sua pronta disponibilidade e capacidade multipotente ^1,2. Essas células têm o potencial de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipócitos, osteoblastos e condrócitos, conforme confirmado por vários estudos³.

Nas últimas décadas, a pesquisa e as aplicações terapêuticas de células-tronco aumentaram. O potencial expansivo das células-tronco exige a diversificação das fontes de onde são obtidas. Vários fatores influenciam a eficiência, viabilidade e estaminalidade das células escolhidas. Apesar da existência de vários reservatórios de células-tronco conhecidos, como medula óssea e tecidos adiposos, os procedimentos invasivos, a morbidade do local e as preocupações éticas ligadas a essas fontes muitas vezes limitam sua exploração ^4,5. Dentre as várias fontes de células-tronco, as células-tronco dentárias têm ganhado atenção devido à sua fácil acessibilidade, alta plasticidade e diversas aplicações potenciais. As células-tronco da polpa dentária humana, em particular, têm sido extensivamente pesquisadas por suas perspectivas terapêuticas⁶. Os dentes, comumente descartados como resíduos médicos, contêm uma grande quantidade de células-tronco mesenquimais⁷. Proteger esse valioso pool de células-tronco requer esforços coletivos de pacientes, dentistas e médicos para garantir que esses recursos não sejam desperdiçados, tornando cada célula-tronco da polpa dentária disponível para futuras necessidades regenerativas.

As células-tronco derivadas da polpa dentária, como células-tronco da polpa dentária adulta humana (DPSCs) e células-tronco de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED), estão localizadas no nicho perivascular da polpa dentária. Acredita-se que essas células se originem de células da crista neural craniana e exibam marcadores precoces para células-tronco mesenquimais (MSCs) e células-tronco neuroectodérmicas. DPSCs e SHEDs demonstraram multipotência e capacidade de regenerar diversos tipos de tecidos⁸.

As fontes potenciais de células-tronco dentárias abrangem dentes decíduos e permanentes saudáveis. As células-tronco constituem apenas cerca de 1% da população total de células na polpa, destacando a importância de técnicas eficazes de isolamento e expansão⁹. Consequentemente, a extração e expansão dessas células-tronco são etapas fundamentais no isolamento do DPSC¹⁰. Os dentes extraídos ou esfoliados precisam ser armazenados em um meio de transporte rico em nutrientes, como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com Hanks (HBSS).

A obtenção da polpa dentária pode ser obtida por meio de vários métodos, dependendo do tipo de dente ^7,11. Para dentes decíduos com raízes reabsorvidas, a extração pode ser realizada através do ápice radicular. Da mesma forma, brochas farpadas estéreis podem ser usadas para obter polpa de dentes permanentes com ápice aberto imaturo. Nos casos de dentes permanentes com raízes totalmente desenvolvidas, o acesso à câmara pulpar envolve a separação da coroa dentária da raiz. Isso é feito cortando o dente usando um disco de diamante na junção cemento-esmalte. Essa incisão expõe a câmara pulpar, possibilitando a recuperação do tecido pulpar 12,13,14.

As células-tronco da polpa dentária (DPSCs) podem ser isoladas por digestão enzimática (DE) ou crescimento a partir de explantes teciduais (GO), também conhecido como crescimento espontâneo. O método DE emprega enzimas, principalmente colagenase I e dispase, para quebrar o tecido em suspensões unicelulares^15,16. O método OG, mais simples e rápido, consiste em cortar os fragmentos de polpa e colocá-los diretamente em uma placa de cultura, permitindo que as células cresçam a partir dos explantes de tecido¹⁷. Os pesquisadores utilizaram e compararam ambas as técnicas para avaliar as taxas de proliferação celular, preservação de propriedades de células-tronco isoladas, diferenciação e expressão de marcadores de superfície¹⁸. O estabelecimento e padronização de protocolos para aquisição de CPDP com alta eficiência e estaminalidade pode abrir caminho para terapias eficazes e seguras¹⁹. Este protocolo abrange a extração de DPSCs usando digestão enzimática, processamento em laboratório, preservação e diferenciação celular com coloração colorimétrica para adipogênese, osteogênese e condrogênese.

O protocolo descrito neste artigo apresenta um procedimento passo a passo, iniciando-se com o isolamento inicial da polpa dentária do dente, seguido de cultura e manutenção das DPSCs em laboratório, e concluindo com sua caracterização usando marcadores específicos de células-tronco (Figura 1). As técnicas de indução dessas células-tronco em diferentes linhagens celulares, destacando sua multipotência, também são descritas.

Protocolo

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa com seres humanos (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). O uso de dentes extraídos foi realizado seguindo padrões éticos para garantir a integridade, dignidade e direitos dos participantes. Os participantes selecionados para este estudo foram indivíduos saudáveis com menos de 30 anos de idade que necessitaram de exodontia para tratamento ortodôntico. Aqueles com cárie dentária extensa ou periodontite grave foram excluídos do estudo. Foram coletados dentes decíduos de crianças que necessitaram da extração de dentes retidos. O consentimento informado por escrito também foi obtido dos sujeitos envolvidos neste estudo.

1. Extração e transporte de dentes

1. Coleta de dentes decíduos e permanentes
   1. Explique aos participantes o objetivo do procedimento e o potencial uso dos dentes extraídos para fins de pesquisa.
   2. Realize a extração dos dentes sob anestesia local, administrando um agente anestésico nas proximidades do dente a ser extraído. Especificamente, 1,75 mL de lidocaína misturada com epinefrina (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:200.000 foi injetada para este estudo. A seleção de dentes que não apresentem cárie dentária grave ou periodontite é preferível^20,21.
2. Transporte dos dentes extraídos
   NOTA: Recomenda-se trabalhar em condições assépticas para evitar contaminação. Isso inclui o uso de equipamentos de proteção individual, como luvas e jaleco, e o trabalho em um ambiente estéril, como uma capa de fluxo laminar de risco biológico.
   1. Depois que o dente for extraído, enxágue-o com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue e outros detritos. Usando uma pinça estéril e bisturi, remova cuidadosamente quaisquer restos de tecido mole da superfície do dente (Figura 2A).
   2. Mergulhe o dente em uma solução desinfetante, como etanol a 70%, por 10 s. Após a desinfecção, enxágue o dente com PBS estéril para remover qualquer desinfetante residual.
   3. Coloque o dente em um recipiente estéril contendo o meio de transporte.
      NOTA: O meio de transporte consistia em Alpha-MEM, um meio de cultura comercial suplementado com antibióticos: 100 U / mL de penicilina / estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Este meio forneceu nutrientes essenciais às células dentro do dente extraído, garantindo sua sobrevivência até o processamento laboratorial. Os antibióticos serviram para inibir o crescimento bacteriano.
   4. Mantenha uma temperatura de 4 °C durante o transporte para retardar as atividades metabólicas celulares e retardar a morte celular. Transporte o dente para o laboratório para as próximas etapas, incluindo o processamento e isolamento das células-tronco da polpa dentária.

2. Coleta de tecido pulpar

1. Prenda o dente usando uma pinça dentária para garantir que ele permaneça no lugar durante o procedimento. Use um disco diamantado para cortar o dente em uma peça de mão odontológica (consulte a Tabela de Materiais) conectada a um refrigerante de água (Figura 2B).
   NOTA: O objetivo é expor a câmara pulpar sem causar danos desnecessários ao tecido pulpar interno.
2. Utilize uma escavadeira odontológica (consulte a Tabela de Materiais) para remover o tecido pulpar. Este instrumento permite a extração da polpa sem causar danos, preservando assim a viabilidade das células-tronco da polpa dentária (Figura 2C).
3. Coloque o tecido obtido em uma placa de Petri de vidro. Lave o tecido pulpar com solução salina tamponada com fosfato.

3. Digestão do tecido pulpar e isolamento celular

1. Trituração e digestão de tecidos
   1. Com uma lâmina cirúrgica estéril, pique cuidadosamente o tecido pulpar em pequenos fragmentos (Figura 2D) e coloque-o em um mini moedor de lenços de papel com PBS para obter uma mistura finamente homogeneizada. Esse processo aumenta a área de superfície do tecido, facilitando a ação enzimática mais eficiente durante a digestão.
   2. Transfira os fragmentos de tecido homogêneo picados para um tubo de 15 mL e digerir enzimaticamente utilizando uma mistura de 3 mg / mL de colagenase tipo I e 4 mg / mL de dispase (ver Tabela de Materiais). Essas enzimas foram dissolvidas na Solução Saleira Balanceada de Hank (HBSS) para atingir as concentrações desejadas.
   3. Incubar o tecido pulpar na mistura enzimática (etapa 3.1.2) durante cerca de 2 h a 37 °C. Após a incubação, neutralizar as enzimas e recolher as células por centrifugação (passo 3.2.1) para posterior cultura.
2. Centrifugação e ressuspensão
   1. Após a incubação, transfira o tecido digerido para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células. Esta etapa separa as células dos fragmentos de tecido e enzimas não digeridos restantes. Descarte cuidadosamente o meio sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet celular no fundo do tubo.
   2. Ressuspenda o pellet celular em um meio de cultura fresco. Este meio fornece os nutrientes e o ambiente necessários para que as células isoladas sobrevivam e proliferem.

4. Cultura celular

1. Plaqueamento e incubação de células
   1. Transferir cuidadosamente as células ressuspensas para um balão de cultura de 25 cm².
      NOTA: Todo o material de uma única polpa é transferido para um único balão de cultura de² células de 25 cm. Um volume de mídia de 5-7 mL garante cobertura suficiente e disponibilidade de nutrientes para as células. Certifique-se de que o meio de cultura para DPSCs seja o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% -20% de soro fetal bovino (FBS) (consulte a Tabela de Materiais) para fornecer os fatores de crescimento necessários. Além disso, suplemente o meio com penicilina / estreptomicina a 1% para evitar a contaminação bacteriana. Certifique-se de que as células estejam uniformemente distribuídas por todo o frasco para promover um crescimento homogêneo.
   2. Incubar o balão a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO₂.
2. Mudança média e monitoramento da confluência
   1. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias para fornecer nutrientes frescos e remover resíduos metabólicos. Para fazer isso, aspire cuidadosamente o meio antigo usando uma pipeta sorológica estéril e substitua-o por um meio novo.
   2. Monitore regularmente a cultura de células ao microscópio para rastrear o crescimento das células e verificar se há sinais de contaminação.
   3. Continue esse processo até que as células atinjam 80% -90% de confluência, o ponto em que as células cobrem a maior parte da área de superfície do frasco, mas não estão excessivamente lotadas.
3. Tripsinização celular e passagem ou congelamento
   1. Quando as células atingirem 80% -90% de confluência, remova o meio de cultura e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio residual e as células não aderentes.
   2. Adicione uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% ao frasco para separar as células da superfície do frasco. Incubar durante 2-5 min a 37 °C até as células levantarem.
   3. Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura e, em seguida, pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir o descolamento celular completo.
   4. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células.
   5. Ressuspenda as células em um meio de cultura fresco e coloque-as novamente em placas (passagem) para crescimento adicional ou congele-as para uso futuro. Ao congelar, use um meio de congelamento que contenha um crioprotetor, como o DMSO, para proteger as células contra danos durante o congelamento.

5. Caracterização das DPSCs

1. Análise de citometria de fluxo
   1. Para confirmar a natureza das células-tronco mesenquimais das células isoladas, realize a análise de citometria de fluxo^22,23. Inicialmente, tripsinize e colete células conforme descrito na etapa 4.3.
   2. Determine a viabilidade celular pela técnica de exclusão do corante tripano. Realize a análise usando um analisador de viabilidade celular (consulte a Tabela de Materiais) durante a^2ª e^8ª passagens. Realize a análise fenotípica por meio de um citômetro de fluxo durante a^3ª e^7ª passagens.
   3. Após a incubação, lave as células em um tampão de citometria de fluxo para remover o excesso de anticorpos e analise as células usando um citômetro de fluxo.
      NOTA: O tampão de citometria de fluxo é composto por solução salina tamponada com fosfato (1x PBS), 1%-2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de azida sódica (NaN₃). O FBS ou BSA bloqueia a ligação não específica de anticorpos, enquanto a azida de sódio atua como conservante. Uma alta porcentagem de células deve expressar os marcadores de células-tronco mesenquimais e não possui os marcadores hematopoiéticos, confirmando sua identidade como DPSCs²⁴.
   4. Separe as DPSCs e comode-as com anticorpos de imunofluorescência para análise de citometria de fluxo.
      NOTA: A seleção de marcadores para análise por citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais (CTMs) é baseada no consenso estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT), que afirma que as CTMs devem expressar CD105, CD73 e CD90, e não ter a expressão de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA classe II²⁵. Esses marcadores são comumente utilizados em estudos que investigam células-tronco da polpa dentária²⁶. As concentrações de anticorpos para coloração podem variar dependendo do anticorpo específico usado, e recomenda-se seguir as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para diluições de anticorpos e condições de incubação²⁵.
   5. Estabelecer os critérios de classificação ^27,28 para a expressão dos marcadores DC mencionados: menos de 10%, sem expressão; entre 11% e 40%, baixa expressão; uma variação de 41% a 70%, expressão moderada; acima de 71%, alta expressão.
   6. Além disso, confirme a ausência de marcadores hematopoiéticos incubando uma alíquota celular separada com anticorpos contra CD34 e CD45.

6. Diferenciação de várias linhagens

NOTA: As etapas a seguir descrevem protocolos para diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica de células-tronco dentárias. Comece semeando culturas a uma densidade de 1 x 10,5 células por poço em uma placa de cultura de tecidos revestida com fibronectina com meio completo (CM). Monitore o crescimento celular até que 80% -90% de confluência seja alcançada antes de iniciar o protocolo de diferenciação desejado. Para avaliar o potencial de diferenciação multilinhagem das DPSCs, inicie o processo de diferenciação em direção a osteoblastos, adipócitos e condrócitos semeando células em placas de 24 poços e cultivando-as em meios de diferenciação apropriados.

1. Diferenciação osteogênica
   1. Inicie cultivando DPSCs em um meio de crescimento regular sob condições padrão até que atinjam 70% -80% de confluência.
   2. Remova o meio de crescimento das células e, em seguida, lave as células uma vez com 1x PBS. Adicione o Meio de Diferenciação Osteogênica (ODM) às células.
      NOTA: O ODM consiste em meio essencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado com 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona (ver Tabela de Materiais).
   3. Incubar as células no meio osteogênico a 37 ° C com 5% de CO₂. Troque o meio osteogênico a cada 2-3 dias.
      NOTA: Após 14 a 21 dias, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a osteoblastos. Isso pode ser confirmado verificando se há um aumento na expressão de marcadores específicos para osteoblastos, como a fosfatase alcalina, ou usando técnicas de coloração para detectar matriz mineralizada, como a coloração com vermelho de alizarina S.
   4. Fixe as células incubando-as com etanol gelado a 70% por 1 h a -20 °C.
   5. Manchar as células fixas com solução de coloração 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) à temperatura ambiente no escuro por 10-15 min. Visualize a coloração ao microscópio para confirmar a diferenciação osteogênica (Figura 3). Confirmar a diferenciação colorando as células com Vermelho de Alizarina S, que identifica depósitos de cálcio indicativos de mineralização^29,30.
2. Diferenciação adipogênica
   1. Conforme detalhado na seção anterior, cultive DPSCs em condições padrão em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
   2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação adipogênica. Este meio geralmente consiste em DMEM, 10% FBS, 10 μg / mL de insulina, 1 μM de dexametasona, 200 μM de indometacina e 0,5 mM de IBMX (ver Tabela de Materiais).
   3. Troque o meio de diferenciação a cada 3-4 dias. Após cerca de 3 semanas, lave as DPSCs diferenciadas com PBS e fixe-as com paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min em temperatura ambiente.
   4. Pinte as células fixadas com Oil Red O (consulte a Tabela de Materiais) para visualizar o acúmulo de gotículas lipídicas (Figura 4). Para confirmar ainda mais a diferenciação adipogênica, realize a análise da expressão gênica de marcadores adipogênicos, como o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e adiponectina^31,32.
3. Diferenciação condrogênica
   1. Culturas de DPSCs mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C são usadas para diferenciação condrogênica. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
   2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação condrogênica, que normalmente contém meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com alto teor de glicose, 1% de ITS, dexametasona 100 nM, 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL de prolina e 10 ng/mL de fator de crescimento transformador-beta 3 (TGF-β3) (ver Tabela de Materiais).
   3. Mantenha as células no meio de diferenciação condrogênica, trocando o meio a cada 2-3 dias. Após cerca de três semanas, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a condrócitos.
   4. Fixe as células incubando-as com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente. Após a fixação, core as células com Azul de Alcian (ver Tabela de Materiais) e visualize-as ao microscópio para confirmar a diferenciação condrogênica (Figura 5).
   5. Confirmar a diferenciação de DPSCs em condrócitos usando técnicas como coloração Alcian Blue para proteoglicanos ou análise da expressão gênica de marcadores condrogênicos como agrecan, SOX9 e colágeno tipo II^33,34.

Resultados

A execução bem-sucedida do protocolo delineado produziu células-tronco pulpares dentárias (DPSCs) capazes de diferenciação de múltiplas linhagens, demonstrando sua multipotência.

Ensaios de viabilidade
A viabilidade dos DPSCs foi avaliada usando um ensaio de exclusão de Trypan Blue em vários momentos. Os resultados mostram uma viabilidade consistentemente alta (maior que 95%) ao longo do período de cultivo, demonstrando a robustez de nosso protocolo de isolamento...

Discussão

O protocolo descreve o isolamento, cultura e caracterização de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) de dentes decíduos e permanentes humanos. Inclui uma descrição do armazenamento e proliferação dessas células, bem como a avaliação de seu potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos, adipócitos e condrócitos³⁵.

Chen et ^al.36 demonstraram que as células-tronco da polpa dentária (DPSCs) ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-isobuty-l-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I5879
Acetic acid	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	AS001
Alcian Blue	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	RM471
Alizarin Red S staining solution	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	GRM894
Alkaline phosphatase -Staining kit	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Antibiotic/Antimycotic	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	P4333
Ascorbate-2-phosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	012-04802
Beta-glycerophosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	G9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hood	Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DR	BioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP025	Cell strainer
Centrifuge	REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
Centrifuge	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	1101 | 1102
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth Medium	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AT006	DMEM
Conical tubes (15 or 50 )	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	546021P/546041P	15 mL and 50 mL
Cryo freezing container	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	15-350-50
Cryolabels	Label India:
Cryovial storage boxes	Cryostore Storage Boxes
Cryovials	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	PW1282	Self standing
Culture flask (25 cm²)	Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasks	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCG4/TCG6	T25/T75
Culture Plates	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP129/TCP008	60 mm/100 mm
Dental Diamond Discs	Komet SC 29730, USA		Komet
Dental Spoon Excavator	Brasseler,GA 31419,USA	5023591U0
Dexamethasone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TC185
Dispase	Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.
Dispase	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	MB106
Ethanol -70%	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Fisher Scientific
Extraction forceps	Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	RM9954
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plate	Corning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry buffer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mm	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece	NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan		Ti-Max Z series
Horse Serum	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Indomethacin	Pfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premix	Corning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscope	Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I9516
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	MB063
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrine	DENTSPLY,NC 28277,USA		Citanest
Liquid Nitrogen	Air Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tank	Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
Micropipettes	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany	30020	Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinder	Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USA		ReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezer	Blue Star Limited
Neubauer counting chamber	Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stain	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM)	STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL119
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific,MA, USA		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Proline	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15	Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK	BDF-6955C
Sodium Hypochlorite	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AS102	4% w/v solution
Sterile centrifuge tubes	Tarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL	3M Center, MN 55144-1000,USA		3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tips	Eppendorf India Limited
Surgical Blade Handle	Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA	371030	BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypsin-EDTA	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bath	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	BSW-01D