JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе особое внимание уделяется извлечению, культивированию и сохранению мультипотентных стволовых клеток из пульпы зуба с помощью ферментативного пищеварения. Кроме того, это демонстрирует их способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты, подчеркивая важность точности и последовательности в процессе.

Аннотация

В области регенеративной медицины и терапевтических применений исследования стволовых клеток быстро набирают обороты. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), которые присутствуют как в молочных, так и в постоянных зубах, стали жизненно важным источником стволовых клеток благодаря их доступности, адаптивности и врожденной способности к дифференцировке. DPSC предлагают легкодоступный и обильный резервуар мезенхимальных стволовых клеток, демонстрируя впечатляющую универсальность и потенциал, особенно для регенеративных целей. Несмотря на их многообещающие перспективы, основное препятствие заключается в эффективной изоляции и характеристике DPSC, учитывая их представленность в виде мельчайшей фракции в клетках пульпы зуба. Не менее важно и правильное сохранение этого бесценного клеточного ресурса. Двумя преобладающими методами выделения DPSC являются ферментативное сбраживание (ЭД) и рост из тканевых эксплантов (ОГ), часто называемые спонтанным ростом. Этот протокол сосредоточен в первую очередь на подходе ферментативного расщепления для выделения DPSC, подробно описывая этапы, охватывающие экстракцию, лабораторную обработку и сохранение клеток. Помимо экстракции и сохранения, протокол углубляется в мастерство дифференцировки DPSC. В частности, в нем описываются процедуры, используемые для стимуляции дифференцировки этих стволовых клеток в адипоциты, остеобласты и хондроциты, демонстрируя их мультипотентные свойства. Последующее использование колориметрических методов окрашивания способствует точной визуализации и подтверждению успешной дифференциации, тем самым подтверждая калибр и функциональность выделенных DPSC. Этот всеобъемлющий протокол функционирует как план, охватывающий весь спектр извлечения, культивирования, сохранения и определения характеристик стволовых клеток пульпы зуба. Это подчеркивает значительный потенциал, заложенный в DPSC, продвигающий вперед исследования стволовых клеток и открывающий перспективы для будущих регенеративных и терапевтических прорывов.

Введение

Исследования стволовых клеток процветают в биомедицинской науке благодаря их многообещающему применению в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), полученные из пульпы молочных и постоянных зубов человека, вызвали значительный интерес в качестве источника стволовых клеток благодаря их доступности и мультипотентной способности 1,2. Эти клетки обладают потенциалом к дифференцировке в различные типы клеток, включая адипоциты, остеобласты и хондроциты, что подтверждаетсямногочисленными исследованиями.

За последние несколько десятилетий исследования и терапевтическое применение стволовых клеток резко возросли. Обширный потенциал стволовых клеток требует диверсификации источников, из которых они получаются. На эффективность, жизнеспособность и стволовость выбранных клеток влияет несколько факторов. Несмотря на существование различных известных резервуаров стволовых клеток, таких как костный мозг и жировые ткани, инвазивные процедуры, заболеваемость и этические проблемы, связанные с этими источниками, часто ограничивают их изучение. Среди различных источников стволовых клеток стоматологические стволовые клетки привлекли внимание благодаря своей легкодоступности, высокой пластичности и разнообразным потенциальным применениям. В частности, стволовые клетки пульпы зуба человека были тщательно исследованы на предмет их терапевтических перспектив6. Зубы, обычно выбрасываемые как медицинские отходы, содержат большое количество мезенхимальных стволовых клеток7. Сохранение этого ценного пула стволовых клеток требует коллективных усилий со стороны пациентов, стоматологов и врачей, чтобы гарантировать, что эти ресурсы не будут потрачены впустую, что сделает каждую стволовую клетку пульпы зуба доступной для будущих регенеративных потребностей.

Стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, такие как стволовые клетки пульпы взрослого человека (DPSC) и стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека (SHED), расположены в периваскулярной нише пульпы зуба. Считается, что эти клетки происходят из клеток нервного гребня черепа и демонстрируют ранние маркеры как для мезенхимальных стволовых клеток (МСК), так и для нейроэктодермальных стволовых клеток. DPSC и SHED продемонстрировали мультипотенцию и способность к регенерации различных типов тканей8.

Потенциальными источниками зубных стволовых клеток являются здоровые молочные и постоянные зубы. Стволовые клетки составляют лишь около 1% от общей популяции клеток в пульпе, что подчеркивает важностьэффективных методов выделения и размножения. Следовательно, экстракция и экспансия этих стволовых клеток являются ключевыми этапами выделения DPSC10. Удаленные или отслоившиеся зубы необходимо хранить в богатой питательными веществами транспортной среде, такой как фосфатно-солевой буфер (PBS) или буферизованный солевым раствором Хенкса (HBSS).

Получение пульпы зуба может быть достигнуто с помощью различных методов, в зависимости от типа зуба 7,11. Для молочных зубов с резорбированными корнями удаление может быть выполнено через верхушку корня. Аналогичным образом, стерильные протяжки с зазубринами могут быть использованы для получения пульпы из постоянных зубов с незрелой открытой верхушкой. В случае постоянных зубов с полностью развитыми корнями доступ к пульповой камере предполагает отделение зубной коронки от корня. Это достигается путем разрезания зуба с помощью алмазного диска в месте цементоэмального соединения. Этот разрез обнажает пульповую камеру, что позволяет извлечь пульповую ткань 12,13,14.

Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) могут быть выделены с помощью ферментативного сбраживания (ЭД) или роста из тканевых эксплантов (ОГ), также известного как спонтанный рост. Метод ЭД использует ферменты, в первую очередь коллагеназу I и диспазу, для расщепления ткани на одиночные клеточные суспензии15,16. Метод OG, более простой и быстрый, заключается в измельчении фрагментов пульпы и непосредственном помещении их в культуральную тарелку, что позволяет клеткам вырасти из тканевых эксплантов17. Исследователи использовали и сравнивали оба метода для оценки скорости пролиферации клеток, сохранения свойств изолированных стволовых клеток, дифференцировкии экспрессии поверхностных маркеров. Создание и стандартизация протоколов для получения DPSC с высокой эффективностью и устойчивостью может проложить путь к эффективному и безопасному лечению19. Этот протокол включает в себя экстракцию DPSC с помощью ферментативного расщепления, лабораторную обработку, консервацию и дифференцировку клеток с колориметрическим окрашиванием для адипогенеза, остеогенеза и хондрогенеза.

Протокол, изложенный в этой статье, представляет собой пошаговую процедуру, начиная с первоначального выделения пульпы зуба из зуба, за которой следует культивирование и поддержание DPSC в лаборатории, и заканчивая их характеристикой с помощью специфических маркеров стволовых клеток (рис. 1). Также описаны методы индукции этих стволовых клеток в различные клеточные линии, подчеркивающие их мультипотентность.

протокол

Протокол, изложенный в настоящем документе, соответствует руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека (IRB, Исследовательский центр Пушпагири, штат Керала). Использование удаленных зубов проводилось в соответствии с этическими нормами для обеспечения неприкосновенности, достоинства и прав участников. Участники, отобранные для этого исследования, были здоровыми людьми в возрасте до 30 лет, которым потребовалось удаление зуба для ортодонтического лечения. Пациенты с обширным кариесом зубов или тяжелым пародонтитом были исключены из исследования. Молочные зубы были собраны у детей, которым требовалось удаление ретинированных зубов. Также было получено информированное письменное согласие от субъектов, участвующих в этом исследовании.

1. Удаление и транспортировка зубов

  1. Коллекция молочных и постоянных зубов
    1. Объясните участникам цель процедуры и возможное использование удаленных зубов в исследовательских целях.
    2. Проводите удаление зубов под местной анестезией путем введения обезболивающего средства в непосредственной близости от удаляемого зуба. В частности, для этого исследования вводили 1,75 мл лидокаина, смешанного с эпинефрином (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:200 000. Предпочтительновыбирать зубы, у которых нет тяжелого кариеса или периодонтита.
  2. Транспортировка удаленных зубов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в асептических условиях, чтобы избежать загрязнения. Это включает в себя ношение средств индивидуальной защиты, таких как перчатки и лабораторный халат, и работу в стерильных условиях, таких как биологически опасный капюшон для ламинарного потока.
    1. После удаления зуба прополощите его стерильным фосфатно-солевым раствором (PBS), чтобы удалить кровь и другие загрязнения. С помощью стерильных щипцов и скальпеля осторожно удалите с поверхности зуба все прикрепленные остатки мягких тканей (рисунок 2А).
    2. Погрузите зуб в дезинфицирующий раствор, например, 70% этанол, на 10 с. После дезинфекции промойте зуб стерильным PBS, чтобы смыть остатки дезинфицирующего средства.
    3. Поместите зуб в стерильный контейнер с транспортной средой.
      Транспортная среда состояла из альфа-MEM, коммерческой питательной среды с добавлением антибиотиков: 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина (см. Таблицу материалов). Эта среда снабжала клетки удаленного зуба необходимыми питательными веществами, обеспечивая их выживание до лабораторной обработки. Антибиотики служили для подавления роста бактерий.
    4. Поддерживайте температуру 4 °C во время транспортировки, чтобы замедлить клеточную метаболическую активность и отсрочить гибель клеток. Транспортируйте зуб в лабораторию для следующих этапов, включая обработку и выделение стволовых клеток пульпы зуба.

2. Забор пульповой ткани

  1. Закрепите зуб с помощью зубных щипцов, чтобы он оставался на месте во время процедуры. Используйте алмазный диск для вырезания зуба в стоматологическом наконечнике (см. Таблицу материалов), подключенном к водяной охлаждающей жидкости (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы обнажить пульповую камеру, не вызывая ненужного повреждения пульповой ткани внутри.
  2. Используйте стоматологический экскаватор (см. Таблицу материалов) для удаления ткани пульпы. Этот инструмент позволяет извлекать пульпу без нанесения повреждений, тем самым сохраняя жизнеспособность стволовых клеток пульпы зуба (Рисунок 2C).
  3. Полученную салфетку поместите на стеклянную чашку Петри. Промойте ткань пульпы фосфатно-солевым буфером.

3. Расщепление пульповой ткани и выделение клеток

  1. Измельчение и пищеварение
    1. С помощью стерильного хирургического лезвия тщательно измельчите ткань пульпы на мелкие фрагменты (Рисунок 2D) и поместите ее в мини-измельчитель для тканей с PBS для получения мелкогомогенизированной смеси. Этот процесс увеличивает площадь поверхности ткани, способствуя более эффективному действию ферментов во время пищеварения.
    2. Измельченные однородные фрагменты ткани переложите в пробирку объемом 15 мл и ферментативно расщепляйте с использованием смеси коллагеназы I типа 3 мг/мл и диспазы 4 мг/мл (см. Таблицу материалов). Эти ферменты растворяли в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) для достижения желаемых концентраций.
    3. Инкубируйте ткань пульпы в смеси ферментов (шаг 3.1.2) в течение примерно 2 ч при 37 °C. После инкубации нейтрализуйте ферменты, а клетки соберите центрифугированием (шаг 3.2.1) для дальнейшего культивирования.
  2. Центрифугирование и ресуспендирование
    1. После инкубации переложите переваренную ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл и вращайте при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. На этом этапе клетки отделяются от оставшихся непереваренных фрагментов тканей и ферментов. Осторожно выбросьте надосадочную среду, следя за тем, чтобы не потревожить клеточную гранулу на дне пробирки.
    2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в свежей питательной среде. Эта среда обеспечивает необходимые питательные вещества и среду для выживания и пролиферации изолированных клеток.

4. Культура клеток

  1. Гальванизация и инкубация клеток
    1. Осторожно перенесите ресуспендированные клетки в колбу для культур размером 25 см².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь материал из одной пульпы переносится в одну колбу для клеточных культур размером 25см2 . Объем среды 5-7 мл обеспечивает достаточный охват и доступность питательных веществ для клеток. Убедитесь, что питательной средой для DPSC является модифицированная среда Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), дополненная 10%-20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (см. Таблицу материалов) для обеспечения необходимых факторов роста. Далее дополните среду 1% пенициллином/стрептомицином для предотвращения бактериального заражения. Убедитесь, что клетки равномерно распределены по всей колбе, чтобы способствовать однородному росту.
    2. Инкубируйте колбу при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5%CO2.
  2. Изменение среды и мониторинг конфлюенции
    1. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня, чтобы обеспечить свежие питательные вещества и удалить метаболические отходы. Для этого нужно осторожно отсасывать старую среду с помощью стерильной серологической пипетки и заменить ее свежей средой.
    2. Регулярно контролируйте клеточную культуру под микроскопом, чтобы отслеживать рост клеток и проверять наличие признаков загрязнения.
    3. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока клетки не достигнут 80%-90% конфлюенции, точки, в которой клетки покрывают большую часть поверхности колбы, но не становятся слишком переполненными.
  3. Трипсинизация клеток и пассирование или замораживание
    1. Как только клетки достигнут 80%-90% конфлюенции, удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления остаточной среды и неадгезивных клеток.
    2. Добавьте в колбу раствор 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить клетки от поверхности колбы. Инкубировать в течение 2-5 минут при температуре 37 °C, пока клетки не оторвутся.
    3. Нейтрализуйте трипсин, добавив равный объем питательной среды, затем осторожно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить полную отслойку клеток.
    4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре для гранулирования клеток.
    5. Ресуспендируйте клетки в свежей питательной среде и либо передержите их (пассаж) для дальнейшего роста, либо заморозьте для дальнейшего использования. При замораживании используйте замораживающую среду, содержащую криопротектор, такой как ДМСО, чтобы защитить клетки от повреждений во время замораживания.

5. Характеристика DPSC

  1. Анализ проточной цитометрии
    1. Чтобы подтвердить мезенхимальную природу стволовых клеток выделенных клеток, проводят анализ проточной цитометрии22,23. Первоначально трипсинизируйте и соберите клетки, как описано в шаге 4.3.
    2. Определение жизнеспособности клеток с помощью метода исключения трипанового красителя. Проводите анализ с помощью анализатора жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов) во время2-го и8-го пассажей. Проводят фенотипический анализ с помощью проточного цитометра во время3-го и7-го пассажей.
    3. После инкубации промойте клетки в буфере для проточной цитометрии для удаления избытка антител и проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для проточной цитометрии состоит из фосфатно-солевого буфера (1x PBS), 1%-2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1% азида натрия (NaN3). FBS или BSA блокируют неспецифическое связывание антител, в то время как азид натрия действует как консервант. Высокий процент клеток должен экспрессировать маркеры мезенхимальных стволовых клеток и не иметь гемопоэтических маркеров, что подтверждает их идентичность как DPSCs24.
    4. Отделите DPSC и окрасьте их иммунофлуоресцентными антителами для анализа проточной цитометрии.
      Примечание: Выбор маркеров для анализа проточной цитометрии мезенхимальных стволовых клеток (МСК) основан на консенсусе, достигнутом Международным обществом клеточной терапии (ISCT), который гласит, что МСК должны экспрессировать CD105, CD73 и CD90 и не иметь экспрессии CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79a или CD19 и HLA класса II25. Эти маркеры обычно используются в исследованиях стволовых клеток пульпы зуба26. Концентрации антител для окрашивания могут варьироваться в зависимости от конкретного используемого антитела, и рекомендуется следовать инструкциям производителя (см. Таблицу материалов) для разведения антител и условий инкубации25.
    5. Установить критерии классификации 27,28 для экспрессии маркеров CD, как указано выше: менее 10%, без экспрессии; от 11% до 40%, низкая экспрессия; диапазон от 41% до 70%, умеренная экспрессия; выше 71%, высокая экспрессия.
    6. Дополнительно подтвердить отсутствие гемопоэтических маркеров путем инкубации отдельной аликвоты клеток с антителами к CD34 и CD45.

6. Многолинейная дифференциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают протоколы остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки стоматологических стволовых клеток. Начните с посева культур с плотностью 1 х 105 клеток на лунку в тканевый культуральный планшет, покрытый фибронектином, с полной средой (КМ). Контролируйте рост клеток до тех пор, пока не будет достигнуто 80%-90% слияние, прежде чем инициировать желаемый протокол дифференцировки. Чтобы оценить мультилинейный дифференцировочный потенциал DPSC, инициируйте процесс дифференцировки в сторону остеобластов, адипоцитов и хондроцитов путем посева клеток в 24-луночные планшеты и культивирования их в соответствующих дифференцировочных средах.

  1. Остеогенная дифференцировка
    1. Начните с культивирования DPSC в обычной питательной среде в стандартных условиях до тех пор, пока они не достигнут 70%-80% конфлюенции.
    2. Удалите питательную среду из клеток, затем промойте клетки один раз 1x PBS. Добавьте в клетки остеогенную среду для дифференцировки (ОДМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ОДМ состоит из альфа-минимальной незаменимой среды (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина, 0,25 μг/мл амфотерицина B, 50 μг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 нМ дексаметазона (см. Таблицу материалов).
    3. Инкубируйте клетки в остеогенной среде при 37 °C с 5%CO2. Меняйте остеогенную среду каждые 2-3 дня.
      Примечание: Через 14-21 день DPSC должны дифференцироваться в остеобластоподобные клетки. Это может быть подтверждено проверкой на увеличение экспрессии остеобласт-специфичных маркеров, таких как щелочная фосфатаза, или использованием методов окрашивания для обнаружения минерализованного матрикса, таких как окрашивание ализарином Red S.
    4. Зафиксируйте клетки, инкубировав их с 70% ледяным этанолом в течение 1 ч при -20 °C.
    5. Окрашивать неподвижные клетки раствором окрашивания Ализарин красный S (pH 4,2) 40 нМ при комнатной температуре в темноте в течение 10-15 минут. Визуализируйте окрашивание под микроскопом, чтобы подтвердить остеогенную дифференцировку (Рисунок 3). Подтвердите дифференцировку путем окрашивания клеток препаратом Ализарин Ред С, который идентифицирует залежи кальция, свидетельствующие о минерализации29,30.
  2. Адипогенная дифференцировка
    1. Как подробно описано в предыдущем разделе, выращивание DPSC в стандартных условиях во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C. Проходите клетки, когда они достигают примерно 70%-80% слияния.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки один раз 1x PBS. Замените вымытую среду средой для адипогенной дифференцировки. Эта среда обычно состоит из DMEM, 10% FBS, 10 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона, 200 мкМ индометацина и 0,5 мМ IBMX (см. Таблицу материалов).
    3. Меняйте среду для дифференцировки каждые 3-4 дня. Примерно через 3 недели промойте дипоген-дифференцированные DPSC PBS и зафиксируйте их 4% параформальдегидом (PFA) на 20 минут при комнатной температуре.
    4. Окрасьте неподвижные клетки маслом Red O (см. Таблицу материалов), чтобы визуализировать накопление липидных капель (Рисунок 4). Для дальнейшего подтверждения адипогенной дифференцировки проведите анализ экспрессии генов адипогенных маркеров, таких как рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ) и адипонектин31,32.
  3. Хондрогенная дифференциация
    1. Для хондрогенной дифференциации используются культуры DPSCs, содержащиеся во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C. Проходите клетки, когда они достигают примерно 70%-80% слияния.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки один раз 1x PBS. Замените вымытую среду средой для хондрогенной дифференцировки, которая обычно содержит модифицированную орлиную среду Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 1% ITS, 100 нМ дексаметазона, 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфата, 40 мкг/мл пролина и 10 нг/мл трансформирующего фактора роста-бета-3 (TGF-β3) (см. Таблицу материалов).
    3. Поддерживайте клетки в среде хондрогенной дифференцировки, меняя среду каждые 2-3 дня. Примерно через три недели DPSC должны дифференцироваться в хондроцитоподобные клетки.
    4. Закрепите клетки, инкубируя их с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации окрашивают клетки альцианским синим (см. Таблицу материалов) и визуализируют их под микроскопом для подтверждения хондрогенной дифференцировки (рис. 5).
    5. Подтвердите дифференцировку DPSC в хондроциты с помощью таких методов, как окрашивание протеогликанов Alcian Blue или анализ экспрессии генов хондрогенных маркеров, таких как аггрекан, SOX9 и коллаген II типа33,34.

Результаты

В результате успешного выполнения описанного протокола были получены стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), способные к многолинейной дифференцировке, демонстрирующие свою мультипотенцию.

Анализы жизнеспособности
Жизнеспособность DPSC оценивалась с помощью анал...

Обсуждение

В протоколе описывается выделение, культивирование и характеристика стволовых клеток пульпы зуба (DPSC) из молочных и постоянных зубов человека. Она включает в себя описание хранения и пролиферации этих клеток, а также оценку их потенциала дифференцировки in vitro в остеобласты, адипоц...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Мэтью Мажаванчерилу, директору и руководителю Исследовательского центра Пушпагири в Тирувалле, за его поддержку в документировании процедур в Исследовательском центре.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

Ссылки

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891 (2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175 (2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. . Regenerative medicine-from protocol to patient. , 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572 (2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945 (2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392 (2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372 (2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114 (2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854 (2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434 (2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -. G., George, J. -. M., Sweety, V. -. K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906 (2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89 (2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531 (2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

DPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены