نمذجة التصلب المتعدد في الجنسين: MOG35-55-التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي الناجم عن

Summary

يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أحد أكثر نماذج الفئران استخداما على نطاق واسع لمرض التصلب المتعدد. في البروتوكول الحالي ، يتم تحصين الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين ، مما يؤدي بشكل رئيسي إلى شلل جزئي تصاعدي في الذيل والأطراف. نناقش هنا بروتوكول التعريف والتقييم EAE.

Abstract

التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتميز بانتشار مختلف بين الجنسين ، مما يؤثر على النساء أكثر من الرجال ، ونتائج مختلفة ، تظهر أشكالا أكثر عدوانية لدى الرجال منها لدى النساء. علاوة على ذلك ، فإن مرض التصلب العصبي المتعدد غير متجانس للغاية من حيث الجوانب السريرية والسمات الإشعاعية والمرضية. وبالتالي ، من الضروري الاستفادة من النماذج الحيوانية التجريبية التي تسمح بالتحقيق في أكبر عدد ممكن من جوانب علم الأمراض. يمثل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) أحد أكثر نماذج مرض التصلب العصبي المتعدد استخداما في الفئران ، حيث يقوم بنمذجة ميزات المرض المختلفة ، من تنشيط الجهاز المناعي إلى تلف الجهاز العصبي المركزي. هنا نصف بروتوكولا لتحريض EAE في كل من الفئران C57BL / 6J من الذكور والإناث باستخدام تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG_35-55) ، مما يؤدي إلى تطور شكل مزمن من المرض. نبلغ أيضا عن تقييم النتيجة السريرية اليومية والأداء الحركي لهذه الفئران لمدة 28 يوما بعد التحصين (28 نقطة في البوصة). أخيرا ، نوضح بعض التحليلات النسيجية الأساسية على مستوى الجهاز العصبي المركزي ، مع التركيز على الحبل الشوكي باعتباره الموقع الرئيسي للتلف الناجم عن المرض.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يظهر وجود تسلل حول الأوعية الدموية للخلايا الالتهابية ، وإزالة الميالين ، وفقدان المحور العصبي ، والتسمم¹. لا تزال مسبباته غير معروفة ، وتشير جوانبه السريرية والتصوير الشعاعي والسمات المرضية إلى عدم تجانس ملحوظ في المرض².

نظرا لمسببات وتعقيده غير المعروفين ، في الوقت الحاضر ، لا يوجد نموذج حيواني يلخص جميع السمات السريرية والإشعاعية المعروضة في MS ^3,4 البشري. ومع ذلك ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من MS

Protocol

تم تنفيذ رعاية والتعامل معها في العمل الحالي وفقا لتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي المؤرخ 22^سبتمبر 2010 (2010/63 / UE) ؛ تمت الموافقة على جميع الإجراءات المبلغ عنها في هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة الإيطالية (407/2018-PR) ولجنة الأخلاقيات بجامعة تورينو (المشروع رقم 360384). نقترح التوافق مع التصميم التجريبي لإرشادات REACH التي نشرها في الأصل Kilkenny et al. في 2010²⁰. قبل البدء ، تأكد من توفر المواد اللازمة (انظر جدول المواد). تعقيم جميع الأواني الزجاجية والأواني المستخدمة لإعداد مستحلب MOG_35-55 في الأوتوكلاف. يتم تمثيل ملخص الإجراءات التجريبية في الشكل 1.

النتائج

متابعة EAE بعد التحصين
وقد تم تقييم ذلك على النحو المبين أدناه.

وزن الجسم وتناول الطعام
يظهر تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) انخفاضا في وزن الجسم لحيوانات EAE من كلا الجنسين ، خاصة خلال الأسبوع الثاني بعد الحث (F _(1,57) <.......

Discussion

أدى بروتوكول EAE الناجم عن MOG_35-55 الذي وصفناه إلى تطوير شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران C57BL / 6J^7،8،13. في هذه النتائج التمثيلية ، أبلغنا أن من كلا الجنسين التي خضعت لإجراء التحصين طورت شكلا مزمنا من المرض (أي أنها لا تتعافى.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic