نمذجة التصلب المتعدد في الجنسين: MOG35-55-التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي الناجم عن

Summary

يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أحد أكثر نماذج الفئران استخداما على نطاق واسع لمرض التصلب المتعدد. في البروتوكول الحالي ، يتم تحصين الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين ، مما يؤدي بشكل رئيسي إلى شلل جزئي تصاعدي في الذيل والأطراف. نناقش هنا بروتوكول التعريف والتقييم EAE.

Abstract

التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتميز بانتشار مختلف بين الجنسين ، مما يؤثر على النساء أكثر من الرجال ، ونتائج مختلفة ، تظهر أشكالا أكثر عدوانية لدى الرجال منها لدى النساء. علاوة على ذلك ، فإن مرض التصلب العصبي المتعدد غير متجانس للغاية من حيث الجوانب السريرية والسمات الإشعاعية والمرضية. وبالتالي ، من الضروري الاستفادة من النماذج الحيوانية التجريبية التي تسمح بالتحقيق في أكبر عدد ممكن من جوانب علم الأمراض. يمثل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) أحد أكثر نماذج مرض التصلب العصبي المتعدد استخداما في الفئران ، حيث يقوم بنمذجة ميزات المرض المختلفة ، من تنشيط الجهاز المناعي إلى تلف الجهاز العصبي المركزي. هنا نصف بروتوكولا لتحريض EAE في كل من الفئران C57BL / 6J من الذكور والإناث باستخدام تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG_35-55) ، مما يؤدي إلى تطور شكل مزمن من المرض. نبلغ أيضا عن تقييم النتيجة السريرية اليومية والأداء الحركي لهذه الفئران لمدة 28 يوما بعد التحصين (28 نقطة في البوصة). أخيرا ، نوضح بعض التحليلات النسيجية الأساسية على مستوى الجهاز العصبي المركزي ، مع التركيز على الحبل الشوكي باعتباره الموقع الرئيسي للتلف الناجم عن المرض.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يظهر وجود تسلل حول الأوعية الدموية للخلايا الالتهابية ، وإزالة الميالين ، وفقدان المحور العصبي ، والتسمم¹. لا تزال مسبباته غير معروفة ، وتشير جوانبه السريرية والتصوير الشعاعي والسمات المرضية إلى عدم تجانس ملحوظ في المرض².

نظرا لمسببات وتعقيده غير المعروفين ، في الوقت الحاضر ، لا يوجد نموذج حيواني يلخص جميع السمات السريرية والإشعاعية المعروضة في MS ^3,4 البشري. ومع ذلك ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من MS ^3,4. في هذه النماذج ، عادة ما يكون بدء المرض مصطنعا للغاية ، ويختلف الإطار الزمني لظهور العلامات السريرية بين البشر والفئران. على سبيل المثال ، في البشر ، لا يتم اكتشاف العمليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء المرض لسنوات قبل ظهور المظاهر السريرية. على العكس من ذلك ، يمكن للمجربين اكتشاف الأعراض في النماذج الحيوانية في غضون أسابيع أو حتى أيام بعد تحريض مرض التصلب العصبي المتعدد⁴.

تنتج ثلاثة نماذج حيوانية أساسية سمات إزالة الميالين التي تميز مرض التصلب العصبي المتعدد: تلك التي يسببها الفيروس (على سبيل المثال، فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر في ثيلر)، وتلك التي تسببها العوامل السامة (على سبيل المثال، كوبريزون، ليسوليسيثين)، والمتغيرات المختلفة لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE)⁵. يساعد كل نموذج في دراسة بعض الجوانب المحددة للمرض ولكن لا شيء يكرر جميع ميزات MS⁶. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار النموذج الصحيح مع مراعاة الاحتياجات التجريبية المحددة والأسئلة العلمية التي يجب معالجتها.

بفضل إجراءات التحصين ضد المستضدات المشتقة من المايلين ، يتم تحفيز EAE عن طريق تحفيز استجابة المناعة الذاتية لمكونات الجهاز العصبي المركزي في الفئران الحساسة. يؤدي التفاعل بين مجموعة واسعة من الآليات المناعية المرضية والعصبية المرضية إلى تطور السمات المرضية الرئيسية لمرض التصلب العصبي المتعدد (أي الالتهاب وإزالة الميالين وفقدان المحور العصبي والتسمم بالدم) في الفئران المحصنة ^7,8. تبدأ الفئران في إظهار الأعراض السريرية في الأسبوع الثاني تقريبا بعد التحصين وتظهر عموما شللا تصاعديا من الذيل إلى الطرف والطرف الأمامي. يتم تقييم النتيجة السريرية (أي القياس الكمي لتراكم العجز المرتبط بالمرض) بشكل عام باستخدام مقياس مكون من 5 نقاط⁷.

يمكن استخدام التحصين النشط بالبروتين أو الببتيد أو النقل السلبي للخلايا التائية الدماغية المنشأ للحث على EAE في الفئران ذات الخلفيات الوراثية المختلفة (على سبيل المثال ، SJL / J ، C57BL / 6 ، والفئران غير المصابة بالسمنة والسكري (NOD). بروتين المايلين البروتيني (PLP) وبروتين الميالين الأساسي (MBP) والبروتين السكري قليل التغصن المياليني (MOG) هي أمثلة على بروتينات الجهاز العصبي المركزي الذاتي التي تنتج منها عادة مولدات المناعة. على وجه الخصوص ، تقوم الفئران SJL / J المحصنة بالخاتمة المناعية ل PLP (PLP_139−151) بتطوير مسار مرض الانتكاس والتحويل (RR) ، بينما تظهر الفئران C57BL / 6J المحصنة بالببتيد MOG_35-55 المناعي EAE ذو الطبيعة^{المزمنة 1}. على الرغم من بعض القيود ، مثل توفير القليل جدا من المعلومات حول تطور مرض التصلب العصبي المتعدد ، أو دور الخلايا البائية في المرض ، أو الآليات من الداخل إلى الخارج ، أو الصعوبات في دراسة إعادة الميالين ، فقد ساهمت نماذج EAE بشكل كبير في فهم عمليات المناعة الذاتية والالتهابات العصبية ، وزيادة المعرفة في مجال مرض التصلب العصبي المتعدد وبالتالي السماح بتطوير مناهج علاجية جديدة لهذا المرض^{4 ، 6}.

في العمل الحالي ، ركزنا على شكل معين من EAE النشط ، وهو ببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG_35-55) - الشكل^{الناجم عن 9،10،11،12}. نماذج EAE المستحثة_{MOG 35-55} شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد. بعد التحصين ، تخضع الفئران لمرحلة بدون أعراض خلال الأسبوع الأول بعد التحصين ، ثم يظهر المرض عادة خلال الأسبوع الثاني بعد التحصين ، بينما بين الأسبوعين الثالث والرابع بعد التحصين ، يصبح المرض مزمنا ، مع عدم وجود إمكانية للشفاء التام من العجز المتراكم^7،8،13. ومن المثير للاهتمام ، أنه لم يتم ملاحظة أي فروق بين الذكور والإناث في الإصابة أو بداية المرض أو مساره أو تقدمه في معظم الدراسات الموجودة في الأدبيات¹⁴ ، حتى لو كانت الدراسات أقل تقارن المرض بين الذكور والإناث.

في المقابل ، في البشر ، من المعروف أن هذه المعلمات تكون ثنائية الشكل جنسيا^{بقوة 2}. يؤثر مرض التصلب العصبي المتعدد على النساء أكثر من الرجال. ومع ذلك ، فإن الرجال عموما يصابون بشكل أكثر عدوانية من المرض². وقد اقترح هذا الدليل دورا أساسيا ومعقدا لهرمونات الغدد التناسلية¹⁵. ومع ذلك ، فإن دور وآلية عمل الهرمونات الجنسية في علم الأمراض لا يزال غير واضح. علاوة على ذلك ، تدعم البيانات من النماذج الحيوانية فكرة أن كلا من هرمون الاستروجين والأندروجينات يمارسان تأثيرات إيجابية على مساحات مختلفة من علم الأمراض بطريقة خاصة بالجنس^16,17.

تشير بعض الدراسات أيضا إلى تأثيرات البروجسترون الواقية للأعصاب والبروميالين والمضادة للالتهابات¹⁸ ، وعلى الرغم من ندرة الأدلة في مرضى التصلب العصبي^{المتعدد 18} ، فإن الستيرويدات العصبية النشطة (أي المنشطات المركبة من قبل الجهاز العصبي ، مثل بريجنينولوني ، رباعي هيدروبروجستيرون ، وثنائي هيدروبروجستيرون) قد تؤثر أيضا على الدورة المرضية¹⁹. بشكل جماعي ، تدعم هذه البيانات فكرة أن الهرمونات الجنسية المنتجة محيطيا وداخل الجهاز العصبي المركزي لها دور مهم وخاص بالجنس في ظهور المرض وتطوره. لذلك ، في العمل الحالي ، نحث على جمع بيانات منفصلة من كل من الذكور والإناث.

من وجهة نظر التشريح المرضي ، تعمل المادة البيضاء للحبل الشوكي كموقع رئيسي لإصابة الجهاز العصبي المركزي في هذا النموذج ، والذي يتميز بمناطق متعددة البؤر ومتقاربة من التسلل الالتهابي أحادي النواة وإزالة الميالين⁸. وبالتالي ، عند وصف هذا البروتوكول لتحريض EAE الناجم عن MOG_35-55 في الفئران C57BL / 6J ، سنأخذ في الاعتبار نتائج المرض في الجنسين ونقدم بعض الأفكار النسيجية المرضية فيما يتعلق بالحبل الشوكي.

Protocol

تم تنفيذ رعاية والتعامل معها في العمل الحالي وفقا لتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي المؤرخ 22^سبتمبر 2010 (2010/63 / UE) ؛ تمت الموافقة على جميع الإجراءات المبلغ عنها في هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة الإيطالية (407/2018-PR) ولجنة الأخلاقيات بجامعة تورينو (المشروع رقم 360384). نقترح التوافق مع التصميم التجريبي لإرشادات REACH التي نشرها في الأصل Kilkenny et al. في 2010²⁰. قبل البدء ، تأكد من توفر المواد اللازمة (انظر جدول المواد). تعقيم جميع الأواني الزجاجية والأواني المستخدمة لإعداد مستحلب MOG_35-55 في الأوتوكلاف. يتم تمثيل ملخص الإجراءات التجريبية في الشكل 1.

1. إعداد مستحلب MOG_35-55

ملاحظة: لتحضير المستحلب ، يلزم وجود MOG_35-55 ، ومساعد فرويد غير المكتمل (IFA) ، وسلالة المتفطرة السلية H37Ra (MT) ، والمحلول الفسيولوجي (انظر جدول المواد).

تنبيه: يمكن أن يحفز MT المقتول بالحرارة الاستجابة المناعية الفطرية. تجنب الاستنشاق والابتلاع والتلامس مع الجلد والعينين باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ووزن MT في ميزان دقيق مغطى أسفل الغطاء.

حل	تكوين	تلاحظ
2 ملغ / مل MOG35-55 محلول الببتيد	الببتيد MOG35-55 المجفف بالتجميد المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 2 مجم / مل	الحفاظ على الحل المخفف بالفعل عند -80 درجة مئوية.
محلول PT 5 ميكروغرام / مل	PT المجفف بالتجميد المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 5 ميكروغرام / مل.	الحفاظ على الحل المخفف بالفعل عند -80 درجة مئوية.
مستحلب	الحجم الإجمالي للمستحلب اللازم لكل فأر ليتم تحصينه هو 300 ميكرولتر مقسمة على النحو التالي:	لتجنب البدائل أو التلوث ، قم بإعداد المستحلب في يوم التحصين.
	200 ميكروغرام / فأر من MOG35-55 ، أي 100 ميكرولتر من محلول MOG35-55 2 مجم / مل.
	50 ميكرولتر من المحلول الفسيولوجي
	150 ميكرولتر من IFA
	4 ملغم/مل طن متري، أي 1.2 ملغم/فأر
الحل الفسيولوجي	كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ مخفف في الماء المقطر.

الجدول 1: تكوين الحلول المستخدمة لإجراء التحصين.

1. تحضير الحل في دورق زجاجي ، إضافة المكون السائل أولا وأخيرا MT.
   ملاحظة: الحجم الإجمالي للمستحلب اللازم لتحصين كل فأر هو 300 ميكرولتر ، مقسوما كما هو موضح في الجدول 1. المستحلب لزج وسميك للغاية ، لذلك أثناء إجراء التحضير والحقن ، قد يكون هناك بعض الخسارة ، خاصة عند تحضير المحلول لعدد قليل من الفئران. نقترح حساب الحجم النهائي للمستحلب المطلوب عن طريق المبالغة في تقدير عدد الفئران المراد تحصينها بما لا يقل عن 1.5-2 ضعف.
2. ضع الدورق في الثلج واستخدم المحقنة الزجاجية بإبرة 18 جم لبدء استحلاب المحلول.
   ملاحظة: يمكن أيضا تحضير المستحلب باستخدام استراتيجيات أخرى ، على سبيل المثال ، عن طريق توصيل المحقنتين الزجاجيتين المجانيتين بالهواء بمحبس ثلاثي الاتجاهات وخلط المحلول عن طريق دفع الغطاسين ذهابا وإيابا^21,22.
3. استحلاب المحلول لمدة 15 دقيقة على الأقل ؛ بشكل عام ، 30 دقيقة من الاستحلاب كافية. للتحقق من جودة المستحلب ، أضف قطرة من المستحلب في وعاء شفاف مملوء بالماء: إذا حافظت القطرة على هيكلها وبقيت سليمة ، فإن المستحلب جاهز.
4. ضع المستحلب مباشرة داخل المحاقن سعة 1 مل التي سيتم استخدامها للتحصين وقم بتخزينها في درجة حرارة +4 درجة مئوية حتى الاستخدام للحفاظ على سمك المستحلب وتجنب التعديلات أو التلوث.

2. اختيار والتحصين

1. اختيار
   1. حدد الفئران البالغة C57BL / 6J من كلا الجنسين في عمر 8-10 أسابيع مع وزن الجسم الأمثل ~ 20 جم. تأكد من اختيار الفئران المتطابقة مع العمر والجنس لمجموعات تجريبية مختلفة لأن القابلية للإصابة بالمرض يمكن أن تختلف باختلاف العمر والجنس.
      ملاحظة: يجب أن يكون وزن جسم الفئران مشابها في يوم التحصين لأن الإجراء الحالي محسن لنطاق معين من وزن الجسم (17-25 جم).
   2. إيواء من نفس الجنس في مجموعات (ن = 4-5 / قفص) لتجنب العزلة الاجتماعية في الظروف القياسية في أقفاص فأر البولي بروبلين 45 سم × 25 سم × 15 سم عند 22 ± 2 درجة مئوية ، تحت 12:12 دورة الضوء / الظلام (تضاء الأنوار في الساعة 08:00 صباحا). توفير الغذاء والماء حسب الطلب.
      ملاحظة: في نهاية المطاف ، للحد من التباين المحتمل لمسار المرض في المحصنة ، نقترح أيضا تشكيل مجموعات تجريبية عديدة بما فيه الكفاية. هناك أيضا دراسات ^8,23 تصف توقيت التحصين كشرط يحدد التباين في نتائج EAE. وبالتالي ، نقترح إجراء التحصين في نفس الساعة تقريبا في جميع ، ويفضل أن يكون ذلك خلال الساعات الضوئية لدورة الضوء / الظلام اليومية²³. للحد من الإجهاد ، من الأفضل التلاعب بالحيوانات قبل يوم التحصين ووضع علامة عليها للتعرف عليها بسهولة للتقييم اليومي ، على سبيل المثال ، قص الأذن أو العلامة.
2. إجراء التحصين
   ملاحظة: تأكد من تنفيذ الإجراء من قبل محقق متمرس لتقليل الضغط على وتحسين التحصين. قبل البدء في التحصين ، حدد طريقة التخدير وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية والأخلاقية. يستخدم مختبرنا تخديرا قصيرا مع الأيزوفلوران.
   1. تخدير الماوس: 4٪ إيزوفلوران لتحريض التخدير و 1.5-2٪ إيزوفلوران لصيانة التخدير. انتظر حتى يكون التخدير فعالا واستخدم قرصة إصبع القدم الخلفية والأمامية لتقييم مستوى التخدير. لمنع جفاف العينين أثناء تخدير الفأر ، استخدم مرهما للعين معتمدا من الطبيب البيطري.
   2. حقن PT في الوريد في الوريد الذيلي الجانبي: قم بتوصيل ذيل الفأر برفق بمحلول الإيثانول ، الذي يعمل كموسع للأوعية ، لعرض الأوردة. ركز على أحد الأوردة الجانبية للذيل ، وباستخدام حقنة 0.5 مل مزودة بإبرة 30 جم ، قم بحقن 500 نانوغرام من PT (أي 100 ميكرولتر من PT المخفف في محلول فسيولوجي بتركيز 5 ميكروغرام / مل).
   3. الحقن تحت الجلد من مستحلب MOG_35-55 : باستخدام حقنة 1 مل بإبرة 26 جم ، قم بإجراء ثلاث حقن تحت الجلد من المستحلب المعد مسبقا: اثنان تحت الجزء المنقاري من الأجنحة وواحد في قاعدة الذيل. حجم المستحلب المحقون في كل موقع هو 100 ميكرولتر ، لحجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر من المستحلب المحقون في كل فأر.
      ملاحظة: يسجل يوم التمنيع على أنه اليوم 0 بعد التمنيع (dpi)؛ بعد 48 ساعة (أي عند 2 نقطة في البوصة) ، من الضروري إجراء حقن وريدي آخر من PT يساوي الحقن الذي تم إجراؤه مسبقا. من الممكن إجراء الحقن بدون تخدير ، باستخدام مقيد الماوس. يهدف الإجراء الموصوف هنا إلى تحفيز والحفاظ على تخدير الفئران أثناء إجراء التحصين لتجنب الانزعاج المحتمل وحركات أو المخاطر لكل من الفئران والمحققين. وبالتالي ، لا توجد عمليات جراحية. ومع ذلك ، لتحسين العمليات التجريبية ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة مناسبة خلال هذه الخطوات ومراقبة حالة الماوس بعد هذه الإجراءات.
   4. للتحقق من تعافي الفأر من الحقن ، ضعه في قفص نظيف بعد الإجراءات وانتظر حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. بعد أن يتعافى الماوس تماما ، أعده إلى قفص المنزل مع الأخرى.

3. متابعة EAE

1. وزن الجسم وتناول الطعام
   1. راقب يوميا وزن الجسم (BW) للحيوانات ، باستخدام ميزان الدقة الإلكترونية ، لأن الانخفاض في الأسلحة البيولوجية هو مؤشر على تطور المرض.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز هذا الانخفاض نسبة معينة ، وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية والأخلاقية لرعاية. عادة ، إذا فقد أكثر من 20٪ من وزن الجسم الأولي (أي الوزن المسجل عند 0 نقطة في البوصة) ، فيجب التضحية به كتطبيق لنقطة النهاية الإنسانية. تتضمن طرق القتل الرحيم تخديرا عميقا لا رجعة فيه للاستنشاق (على سبيل المثال ، 5٪ إيزوفلوران) يليه قطع الرأس.
   2. راقب كمية الطعام (FI) - الطعام الذي يأكله في يوم واحد (g∙^day-1∙^animal-1) ، ووزن كمية الطعام في الحاوية المحددة مرة واحدة على الأقل في الأسبوع ، وقسمة كمية الطعام المأكول للأيام التي مرت بين قياسين متتاليين وعدد الموجودة في القفص.
      ملاحظة: يسمح هذا القياس بتقدير متوسط تناول الطعام. بسبب ظهور وتراكم علامات المرض السريري ، والتي تنطوي على شلل الأطراف ، نقترح وضع بعض الطعام المائي على أرضية القفص عندما تكون غير قادرة على الوقوف بثبات على أطرافها الخلفية والوصول إلى حاوية الطعام أو زجاجة الماء. لتقييم تناول الطعام خلال فترة المتابعة بأكبر قدر ممكن من الدقة ، قمنا أيضا بقياس الوزن الجاف لهذا الطعام قبل ترطيبه للفئران.
2. تقييم الدورة الشهوانية خلال EAE
   1. تحقق من الدورة الشحمية لدورتين على الأقل ، وتقييم مسحات الخلايا المهبلية كما وصفها McLean et ^al.24. صنف مرحلة الدورة الشحمية بناء على وجود ثلاثة أنواع من الخلايا الأولية - الخلايا الظهارية ذات النواة ، والخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة ، والكريات البيض - في عينات اللطاخة المهبلية ، على النحو التالي:
      1. تصنف على أنها نثر بناء على وجود حصري تقريبا لمجموعات من الخلايا الظهارية المستديرة جيدة التكوين.
      2. تصنف على أنها شبق بناء على الوجود السائد لمجموعات كثيفة من الخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة.
      3. تصنف على أنها metestrus على أساس الوجود السائد للكريات البيض الصغيرة الملطخة بالظلام والوجود الطفيف للخلايا الظهارية الحرشفية المتقرنة.
      4. تصنف على أنها ديسترو بناء على الوجود السائد للغاية للكريات البيض الصغيرة الملطخة بالظلام والخلايا الظهارية الحرشفية النادرة جنبا إلى جنب مع المظهر المحتمل للخلايا الظهارية النواة.
         ملاحظة: عند تقييم المرض في كلا الجنسين ، من المهم التحقق من التباين في الإناث بسبب الدورة الشبقية. نقترح التركيز على تقييم الدورة الشهوانية ، خاصة بين الأسبوع الأول والثاني بعد التمنيع (أي خلال المرحلة الحادة من EAE). لقد ثبت سابقا أن إجراء التحصين يسبب التغييرات الأكثر وضوحا في الدورة الشحمية ضمن هذه المرحلة²⁵. علاوة على ذلك ، من المهم مراعاة أن إجراء اللطاخة عندما يصل إلى درجة سريرية عالية (خاصة >3) أمر صعب بسبب شلل جزئي خلفي ونقص النغمة في الأطراف الخلفية.
3. النتيجة السريرية
   1. اطلب من محقق أعمى تقييم النتيجة السريرية للحيوانات يوميا. خصص لكل درجة مصنفة من 0 إلى 5 (انظر الجدول 2) لتقييم مسار المرض²⁶ كما هو موضح في Racke⁷.
      ملاحظة: على غرار انخفاض وزن الجسم ، فإن نقطة النهاية الإنسانية ضرورية أيضا لزيادة الدرجات السريرية ، وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية والأخلاقية لرعاية. بشكل عام ، إذا لم يعد قادرا على إطعام نفسه بشكل مستقل (يحدث هذا عادة عندما يصل إلى درجة 4 على الأقل ، وفقا للمقياس الذي نستخدمه) ، فيجب التضحية به كتطبيق لنقطة النهاية الإنسانية.
4. تقييم الأداء الحركي عن طريق اختبار الروتارود
   ملاحظة: عادة ما يتم إجراء تقييم تقدم EAE عن طريق تعيين النتيجة السريرية يوميا ، والتي يتم إجراؤها بواسطة محقق أعمى مدرب تدريبا كاملا. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد إحاطته بتقييم كمي وموضوعي أكثر لتطور المرض. في دراسة سابقة²⁶ ، تم استخدام اختبار الروتارود لقياس الأداء الحركي للحيوانات المحصنة. كما وصفه van den Berg et ^al.27 ، للحصول على تقييم سريري أكثر كمية ودقة لمسار المرض ، يمكن أن يدعم تقييم الأداء الحركي بواسطة اختبار الروتارود تقييم النتيجة السريرية. وللاطلاع على وصف مفصل، انظر van den Berg et ^al.27.
   1. دع الفئران تخضع لجلسات دوارة يوميا ، بدءا من 1 نقطة في البوصة حتى التضحية (أي 28 نقطة في البوصة). تتكون كل جلسة من جلسة واحدة مدتها 300 ثانية يجب خلالها زيادة سرعة القضيب خطيا من 4 إلى 40 دورة في الدقيقة.
   2. تسجيل درجة. عندما يكون الماوس غير قادر على الحفاظ على توازنه ويسقط من الجهاز ، فإنه يسقط على الأرض ويشغل جهاز استشعار ، ويتم تسجيل الوقت (الأوقات). وبالتالي ، يتم تسجيل الأداء على أنه زمن انتقال إلى السقوط (السقوط).

درجة	علامة سريرية		وصف
0	صحي		لا توجد علامة سريرية ملحوظة. يظهر نغمة طبيعية وحركة الذيل. يمشي دون تعثر.
0.5	بوابة ضعيفة		رحلات أثناء المشي على الشواية.
1	ذيل يعرج		عندما يتم التقاط على أساس الذيل ، يتدلى الذيل (الذيل المترهل).
1.5	ذيل عرج وبوابة ضعيفة		يظهر ذيلا مترهلا ، ويسافر أثناء المشي على الشواية.
2	رنح		يظهر صعوبات في الوقوف بمجرد قلبه على ظهره.
2.5	ترنح وشلل جزئي في الأطراف الخلفية		لا يمكن لعروض الوقوف بمجرد قلبها على ظهرها ، وتفقد نغمة أحد أطرافها الخلفية.
3	شلل الأطراف الخلفية		يفقد لهجة كل من الأطراف الخلفية.
3.5	شلل الأطراف الخلفية و / أو شلل جزئي في الطرف الأمامي		يفقد لهجة كل من الأطراف الخلفية وجزئيا من الأطراف الأمامية. في الواقع ، يظهر فقدان القوة في قبضة الأطراف الأمامية.
4	شلل جزئي تترا		يفقد تماما لهجة أطرافه.
4.5	شلل جزئي تترا وانخفاض درجة حرارة الجسم		يفقد تماما نغمة أطرافه ، ويظهر انخفاضا في درجة حرارة الجسم (إنه بارد).
5	الموت أو الموت		يموت (لا يستجيب لأي حافز) أو ميت.

الجدول 2: نظام التسجيل السريري المستخدم لتقييم تقدم EAE.

4. تقييم العلامات النسيجية المرضية التي يسببها EAE على مستوى الحبل الشوكي

ملاحظة: هنا ، نبلغ بإيجاز عن إجراء التضحية بالحيوانات وجمع الحبال الشوكية لإجراء التحليل النسيجي المرضي. للحصول على وصف مفصل ، راجع هذه المراجع^{10،26،28،29}.

1. التثبيت وأخذ عينات الأنسجة
   ملاحظة: للحصول على وصف تفصيلي ، راجع هذه المراجع^10،26.
   1. التضحية بالحيوانات في 28 نقطة في البوصة خلال المرحلة المزمنة من المرض.
      1. تخدير الفئران عن طريق التخدير العميق الذي لا رجعة فيه (الحقن داخل الصفاق من زولازيبام وتيليتامين 80 مجم / كجم / زيلازين 10 مجم / كجم).
      2. تتسرب الفئران عبر القلب بمحلول ملحي متبوعا بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA).
         ملاحظة: انتبه أثناء استخدام PFA: نظرا لأنه سام ، تجنب الاستنشاق والابتلاع والتلامس مع الجلد والعينين باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. وزن المسحوق ، وإعداد الحل ، وإجراء التروية تحت غطاء محرك السيارة.
   2. إزالة الحبل الشوكي من العمود الفقري³⁰.
   3. قم بتخزين الحبل الشوكي في محلول PFA بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة.
   4. قم بإجراء عدة غسلات في محلول فوسفات ملحي 0.01 متر (PBS).
   5. تضمين الحبل الشوكي في كتل البارافين³⁰.
2. الإجراءات النسيجية
   ملاحظة: للاطلاع على وصف مفصل، انظر Montarolo et ^al.10.
   1. استخدم ميكروتوم لقطع أقسام الحبل الشوكي المستعرضة بسمك 10 ميكرومتر وجمعها على شرائح مغلفة بالجيلاتين. قم بتوجيه مستوى التقسيم لمطابقة الرسومات المقابلة للمقاطع المستعرضة لأطلس الحبل الشوكي للفأر³¹.
   2. إجراء إزالة البارافين من الأقسام³².
   3. وصمة عار القسم مع الهيماتوكسيلين و Eosin³².
   4. تجفيف الأقسام³².
   5. قم بتغطية الأقسام بوسط تثبيت واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء كيميائي.
      ملاحظة: يسمح تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين بالكشف عن وجود ارتشاح التهابي حول الأوعية الدموية (PvIIs)²⁶ ، والذي يتم تقييمه كعلامة على المرض²⁸.
3. التحليل الكمي لأقسام الحبل الشوكي
   1. احصل على صور للأقسام الملطخة باستخدام مجهر بصري متصل بكاميرا رقمية بهدف 20x²⁹.
   2. قم بتحليل الصورة المكتسبة للحصول على عدد PvIIs ، معبرا عنه بعدد حالات التسلل لكل مم².
      ملاحظة: لتحليل الصور التي تم الحصول عليها ، من المفيد الاستفادة من برنامج تحليل الصور. يتم قياس النتائج المرضية العصبية المقدمة في هذا العمل في 10 مقاطع عرضية كاملة للحبل الشوكي لكل فأر (ن = 8 / مجموعة) تمثل مستويات الحبل الشوكي بأكملها.

النتائج

متابعة EAE بعد التحصين
وقد تم تقييم ذلك على النحو المبين أدناه.

وزن الجسم وتناول الطعام
يظهر تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) (الجنس والوقت كمتغيرات مستقلة) انخفاضا في وزن الجسم لحيوانات EAE من كلا الجنسين ، خاصة خلال الأسبوع الثاني بعد الحث (F _(1,57) <...

Discussion

أدى بروتوكول EAE الناجم عن MOG_35-55 الذي وصفناه إلى تطوير شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران C57BL / 6J^7،8،13. في هذه النتائج التمثيلية ، أبلغنا أن من كلا الجنسين التي خضعت لإجراء التحصين طورت شكلا مزمنا من المرض (أي أنها لا تتعافى...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic