Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Se caracteriza por una prevalencia diferente en los sexos, afectando más a las mujeres que a los hombres, y diferentes resultados, mostrando formas más agresivas en los hombres que en las mujeres. Además, la EM es muy heterogénea en cuanto a aspectos clínicos, características radiológicas y patológicas. Por lo tanto, es necesario aprovechar los modelos animales experimentales que permiten investigar la mayor cantidad posible de aspectos de la patología. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) representa uno de los modelos de EM más utilizados en ratones, modelando diferentes características de la enfermedad, desde la activación del sistema inmune hasta el daño en el SNC. En este trabajo describimos un protocolo para la inducción de EAE en ratones C57BL/6J machos y hembras mediante inmunización con el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG_35-55), que conduce al desarrollo de una forma crónica de la enfermedad. También informamos de la evaluación de la puntuación clínica diaria y el rendimiento motor de estos ratones durante 28 días después de la inmunización (28 dpi). Por último, ilustramos algunos análisis histológicos básicos a nivel del SNC, centrándonos en la médula espinal como el sitio primario de daño inducido por la enfermedad.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Muestra la presencia de infiltración perivascular de células inflamatorias, desmielinización, pérdida axonal y gliosis¹. Su etiología sigue siendo desconocida y sus aspectos clínicos, radiográficos y patológicos sugieren una notable heterogeneidad en la enfermedad².

Debido a su etiología y complejidad desconocidas, en la actualidad, ningún modelo animal recapitula todas las características clínicas y radiológicas mostradas en la EM humana ^3,4. Sin embargo, se emplean varios modelos animales para estudiar diferentes aspectos de la EM ^3,4. En estos modelos, el inicio de la enfermedad suele ser extremadamente artificial, y el período de tiempo de aparición de los signos clínicos es diferente entre humanos y ratones. Por ejemplo, en los seres humanos, los procesos fisiopatológicos subyacentes a la enfermedad no se detectan durante años antes de la aparición de las manifestaciones clínicas. Por el contrario, los experimentadores pueden detectar síntomas en modelos animales dentro de las semanas o incluso días posteriores a la inducción de la EM⁴.

Tres modelos animales básicos producen las características de desmielinización que son características de la EM: las que son inducidas por virus (p. ej., el virus de la encefalomielitis murina de Theiler), las que son inducidas por agentes tóxicos (p. ej., cuprizona, lisolecitina) y las diferentes variantes de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)⁵. Cada modelo ayuda a estudiar algunas facetas específicas de la enfermedad, pero ninguno replica todas las características de la EM⁶. Por lo tanto, es fundamental elegir el modelo correcto teniendo en cuenta las necesidades experimentales específicas y las cuestiones científicas que se abordarán.

Gracias a los procedimientos de inmunización contra antígenos derivados de mielina, la EAE es inducida mediante el desencadenamiento de una respuesta autoinmune a los componentes del SNC en ratones susceptibles. La interacción entre una amplia gama de mecanismos inmunopatológicos y neuropatológicos provoca el desarrollo de los principales rasgos patológicos de la EM (es decir, inflamación, desmielinización, pérdida axonal y gliosis) en los ratones inmunizados ^7,8. Los ratones comienzan a mostrar síntomas clínicos alrededor de la segunda semana después de la inmunización y, por lo general, muestran una parálisis ascendente desde la cola hasta la extremidad y la extremidad anterior. La puntuación clínica (es decir, la cuantificación de la acumulación de déficits relacionados con la enfermedad) se evalúa generalmente mediante una escala de 5 puntos⁷.

La inmunización activa con proteínas o péptidos o la transferencia pasiva de células T encefalitógenas se puede utilizar para inducir EAE en ratones con diferentes antecedentes genéticos (p. ej., SJL/J, C57BL/6 y ratones no obesos-diabéticos (NOD)). La proteína proteolípida de mielina (PLP), la proteína básica de mielina (MBP) y la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) son ejemplos de proteínas del SNC a partir de las cuales generalmente se producen inmunógenos. En particular, los ratones SJL/J inmunizados con el epítopo inmunodominante de PLP (PLP_139-151) desarrollan un curso de enfermedad remitente-recurrente (RR), mientras que los ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido inmunodominante MOG_35-55 muestran EAE de naturaleza crónica¹. A pesar de algunas limitaciones, como la escasa información sobre la progresión de la EM, el papel de las células B en la enfermedad, los mecanismos de adentro hacia afuera o las dificultades en el estudio de la remielinización, los modelos EAE han contribuido enormemente a la comprensión de los procesos autoinmunes y neuroinflamatorios, aumentando el conocimiento en el campo de la EM y permitiendo así el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas para esta enfermedad^{4. 6}.

En el presente trabajo, nos centramos en una forma particular de EAE activa,^{la forma} 9,10,11,12 inducida por el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG_35-55). La EAE inducida por MOG_35-55 modela una forma crónica de EM. Después de la inmunización, los ratones pasan por una fase asintomática dentro de la primera semana después de la inmunización, luego la enfermedad suele surgir durante la segunda semana después de la inmunización, mientras que entre la tercera y cuarta semana después de la inmunización, la enfermedad se vuelve crónica, sin posibilidad de recuperación completa de los déficits acumulados ^7,8,13. Curiosamente, en la mayoría de los estudios presentes en la literatura no se observan diferencias entre hombres y mujeres en cuanto a la incidencia, el inicio de la enfermedad, el curso o la progresión¹⁴, aunque son pocos los estudios que comparan la enfermedad en hombres y mujeres.

Por el contrario, en los seres humanos, se sabe que estos parámetros son fuertemente dimórficos^{sexualmente 2}. La esclerosis múltiple afecta más a las mujeres que a los hombres; Sin embargo, los hombres generalmente desarrollan una forma más agresiva de la enfermedad². Esta evidencia ha sugerido un papel esencial, así como complejo, de las hormonas gonadales¹⁵; Sin embargo, el papel y el mecanismo de acción de las hormonas sexuales en la patología siguen sin estar claros. Además, los datos de modelos animales apoyan la idea de que tanto los estrógenos como los andrógenos ejercen efectos positivos en diferentes tractos de la patología de forma específica para cada sexo^16,17.

Algunos estudios también sugieren efectos neuroprotectores, promielinizantes y antiinflamatorios de la progesterona¹⁸ y, aunque la evidencia en pacientes con EM es escasa¹⁸, los esteroides neuroactivos (es decir, esteroides sintetizados de novo por el sistema nervioso, como la pregnenolona, la tetrahidroprogesterona y la dihidroprogesterona) también podrían afectar el curso patológico¹⁹. En conjunto, estos datos apoyan la idea de que las hormonas sexuales producidas tanto periféricamente como dentro del SNC tienen un papel importante y específico del sexo en la aparición y progresión de la enfermedad. Por lo tanto, en el presente trabajo, instamos a la recopilación de datos separados de los animales machos y hembras.

Desde el punto de vista histopatológico, la sustancia blanca de la médula espinal sirve como el sitio principal de lesión del SNC en este modelo, que se caracteriza por regiones multifocales y confluentes de infiltración inflamatoria mononuclear y desmielinización⁸. Por lo tanto, al describir este protocolo para la inducción de EAE inducida por MOG_35-55 en ratones C57BL/6J, tendremos en cuenta el resultado de la enfermedad en los dos sexos y proporcionaremos algunos conocimientos histopatológicos sobre la médula espinal.

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales en el presente trabajo se realizó de acuerdo con la Directiva del Consejo de la Unión Europea de 22^{de septiembre de} 2010 (2010/63/UE); todos los procedimientos relatados en el presente estudio fueron aprobados por el Ministerio de Salud italiano (407/2018-PR) y por el Comité de Ética de la Universidad de Turín (Proyecto n° 360384). Sugerimos ajustar el diseño experimental a las guías ARRIVE, publicadas originalmente por Kilkenny et al. en 2010²⁰. Antes de comenzar, asegúrese de que los materiales necesarios estén disponibles (consulte la tabla de materiales). Esterilizar toda la cristalería y utensilios utilizados para la preparación de la emulsión MOG_35-55 en autoclave. En la Figura 1 se presenta un resumen de los procedimientos experimentales.

1. Preparación de la emulsión MOG_35-55

NOTA: Para preparar la emulsión, se requiere MOG_35-55, adyuvante de Freud (IFA) incompleto, cepa H37Ra (MT) de Mycobacterium Tuberculosis y solución fisiológica (ver Tabla de Materiales).

PRECAUCIÓN: La MT muerta por calor puede estimular la respuesta inmunitaria innata. Evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos utilizando el equipo de protección personal adecuado y pesando la MT en una balanza de precisión cubierta debajo del capó.

Solución	Composición	Notas
2 mg/ml de solución peptídica MOG35-55	Péptido MOG35-55 liofilizado diluido en solución fisiológica a una concentración de 2 mg/mL	Conservar la solución ya diluida a -80 °C.
5 μg/mL de solución de PT	PT liofilizado diluido en solución fisiológica a una concentración de 5 μg/mL.	Conservar la solución ya diluida a -80 °C.
Emulsión	El volumen total de emulsión necesario para cada ratón a inmunizar es de 300 μL, dividido de la siguiente manera:	Para evitar alteraciones o contaminación, prepare la emulsión el día de la inmunización.
	200 μg/ratón de MOG35-55 , es decir, 100 μL de solución de MOG35-55 2 mg/mL.
	50 μL de solución fisiológica
	150 μL de IFA
	4 mg/mL MT, es decir, 1,2 mg/ratón
Solución fisiológica	Cloruro de sodio al 0,9% diluido en agua destilada.

Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas para el procedimiento de inmunización.

1. Preparar la solución en un vaso de precipitados de vidrio, añadiendo primero el componente líquido y finalmente el MT.
   NOTA: El volumen total de emulsión necesario para cada ratón a inmunizar es de 300 μL, dividido como se indica en la Tabla 1. La emulsión es muy viscosa y espesa, por lo que durante el procedimiento de preparación e inyección, podría haber alguna pérdida, especialmente al preparar la solución para unos pocos ratones. Sugerimos calcular el volumen final de emulsión necesario sobreestimando el número de ratones a inmunizar en al menos 1,5-2 veces.
2. Coloque el vaso de precipitados en hielo y utilice la jeringa de vidrio con una aguja de 18 G para comenzar a emulsionar la solución.
   NOTA: La emulsión también se puede preparar utilizando otras estrategias, por ejemplo, conectando las dos jeringas de vidrio sin aire con una llave de paso de tres vías y mezclando la solución empujando los émbolos hacia adelante y hacia atrás^21,22.
3. Emulsionar la solución durante al menos 15 min; Generalmente, 30 minutos de emulsificación son suficientes. Para comprobar la calidad de la emulsión, agregue una gota de emulsión en un recipiente transparente lleno de agua: si la gota mantiene su estructura y permanece intacta, la emulsión está lista.
4. Colocar la emulsión directamente dentro de las jeringas de 1 mL que se utilizarán para la inmunización y almacenarlas a +4 °C hasta su uso para preservar el espesor de la emulsión y evitar alteraciones o contaminaciones.

2. Selección e inmunización de animales

1. Selección de animales
   1. Seleccionar ratones adultos C57BL/6J de ambos sexos a las 8-10 semanas de edad con un peso corporal óptimo de ~20 g. Asegúrese de seleccionar ratones de la misma edad y sexo para diferentes grupos experimentales, ya que la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el sexo.
      NOTA: Los ratones deben tener un peso corporal comparable el día de la inmunización porque el procedimiento actual está optimizado para un cierto rango de peso corporal (17-25 g).
   2. Alojar a los animales del mismo sexo en grupos (n = 4-5/jaula) para evitar el aislamiento social en condiciones estándar en jaulas de polipropileno de 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 (luces encendidas a las 08:00 AM). Proporcionar comida y agua ad libitum.
      NOTA: Eventualmente, para limitar aún más la variabilidad potencial del curso de la enfermedad en los animales inmunizados, también sugerimos formar grupos experimentales suficientemente numerosos. También existen estudios ^8,23 que describen el momento de la inmunización como una condición que determina la variación en el resultado de la EAE. Por lo tanto, sugerimos realizar la inmunización aproximadamente a la misma hora en todos los animales, preferiblemente durante las horas luz del ciclo diario de luz/oscuridad²³. Para limitar el estrés, es preferible manipular a los animales antes del día de la inmunización y marcarlos para identificarlos fácilmente para su evaluación diaria, por ejemplo, cortando las orejas o marcando.
2. El procedimiento de inmunización
   NOTA: Asegúrese de que el procedimiento sea realizado por un investigador experimentado para minimizar el estrés de los animales y optimizar la inmunización. Antes de iniciar la inmunización, seleccione el método de anestesia de acuerdo con las directrices del comité institucional de ética y cuidado de animales. Nuestro laboratorio utiliza anestesia breve con isoflurano.
   1. Anestesiar al ratón: 4% de isoflurano para la inducción de la anestesia y 1,5-2% de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia. Espere a que la anestesia sea efectiva y use un pellizco en la parte posterior y delantera del pie para evaluar el nivel de anestesia. Para prevenir la sequedad de los ojos mientras el ratón está bajo anestesia, use un ungüento para los ojos aprobado por el veterinario.
   2. Inyección intravenosa de PT en la vena caudal lateral: tapar suavemente la cola del ratón con una solución de etanol, que actúa como vasodilatador, para mostrar las venas. Concéntrese en una de las dos venas laterales de la cola y, utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 30 g, inyecte 500 ng de PT (es decir, 100 μl de PT diluido en solución fisiológica a una concentración de 5 μg/ml).
   3. Inyección subcutánea de emulsión MOG_35-55 : utilizando la jeringa de 1 mL con aguja de 26 G, realizar tres inyecciones subcutáneas de la emulsión previamente preparada: dos debajo de la parte rostral de los flancos y una en la base de la cola. El volumen de emulsión inyectado en cada sitio es de 100 μL, para un volumen total de 300 μL de emulsión inyectada en cada ratón.
      NOTA: El día de la inmunización se registra como el día 0 después de la inmunización (dpi); 48 h después (es decir, a 2 dpi), es necesario realizar otra inyección intravenosa de TP igual a la realizada anteriormente. Es posible realizar la inyección sin anestesia, utilizando un retenedor de ratón. El procedimiento aquí descrito tiene como objetivo inducir y mantener la anestesia de los ratones durante el procedimiento de inmunización para evitar posibles molestias y movimientos de los animales o riesgos tanto para los ratones como para los investigadores. Por lo tanto, no hay procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, para optimizar los procesos experimentales, es importante mantener las condiciones estériles adecuadas durante estos pasos y monitorear la condición del ratón después de estos procedimientos.
   4. Para verificar que el ratón se ha recuperado de las inyecciones, colóquelo en una jaula limpia después de los procedimientos y espere hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Una vez que el ratón se haya recuperado por completo, devuélvelo a la jaula de la casa con otros animales.

3. Seguimiento de EAE

1. Peso corporal e ingesta de alimentos
   1. Controlar diariamente el peso corporal (PC) de los animales, utilizando una balanza electrónica de precisión, ya que la disminución del peso corporal es un indicador de la progresión de la enfermedad.
      NOTA: Esta disminución no debe exceder un determinado porcentaje, de acuerdo con los lineamientos del comité institucional y de ética para el cuidado de los animales. Por lo general, si un animal pierde más del 20% del peso corporal inicial (es decir, el peso registrado a 0 dpi), debe sacrificarse como aplicación del criterio de valoración humanitario. Los métodos de eutanasia implican anestesia profunda irreversible para la inhalación (por ejemplo, isoflurano al 5%) seguida de la decapitación.
   2. Controle la ingesta de alimentos (IF), es decir, los alimentos ingeridos por un animal en un día (g∙^día-1∙^animal-1), pesando la cantidad de alimento en el recipiente específico al menos una vez a la semana y dividiendo la cantidad de alimentos ingeridos durante los días transcurridos entre dos mediciones secuenciales y el número de animales presentes en la jaula.
      NOTA: Esta medida permite estimar la ingesta media de alimentos. Debido a la aparición y acumulación de signos clínicos de la enfermedad, que implican la parálisis de las extremidades, sugerimos colocar algún alimento regado en el suelo de la jaula cuando los animales no sean capaces de pararse firmemente sobre sus extremidades traseras y alcanzar el recipiente de comida o la botella de agua. Para evaluar la ingesta de alimentos durante el período de seguimiento con la mayor precisión posible, también medimos el peso seco de este alimento antes de mojarlo para los ratones.
2. Evaluación de la ciclicidad estral durante la EAE
   1. Comprobar el ciclo estral durante al menos dos ciclos, evaluando los frotis de citología vaginal descritos por McLean et ^al.24. Clasifique la fase del ciclo estral en función de la presencia de tres tipos de células primarias (células epiteliales nucleadas, células epiteliales escamosas cornificadas y leucocitos) en las muestras de frotis vaginal, de la siguiente manera:
      1. Se clasifican como celo en función de la presencia casi exclusiva de grupos de células epiteliales nucleadas redondas y bien formadas.
      2. Se clasifican como estro en función de la presencia predominante de grupos densamente empaquetados de células epiteliales escamosas cornificadas.
      3. Se clasifican como metestro en función de la presencia predominante de pequeños leucocitos teñidos de oscuro y la presencia menor de células epiteliales escamosas cornificadas.
      4. Se clasifican como diestros en función de la presencia altamente predominante de pequeños leucocitos teñidos de oscuro y células epiteliales escamosas córneas raras junto con la posible aparición de células epiteliales nucleadas.
         NOTA: Al evaluar la enfermedad en ambos sexos, es importante verificar la variabilidad en las hembras debido al ciclo estral. Sugerimos centrarse en la evaluación del ciclo estral, especialmente entre la primera y la segunda semana post-inmunización (es decir, durante la fase aguda de la EAE). Se ha demostrado previamente que el procedimiento de inmunización provoca las alteraciones más pronunciadas del ciclo estral dentro de esta fase²⁵. Además, es importante tener en cuenta que la realización del frotis cuando el animal alcanza una puntuación clínica alta (especialmente >3) es difícil debido a la paresia posterior y a la falta de tono en las extremidades posteriores.
3. Puntuación clínica
   1. Haga que un investigador ciego evalúe diariamente la puntuación clínica de los animales. Asigne a cada animal una puntuación de 0 a 5 (véase la Tabla 2) para evaluar el curso de la enfermedad²⁶ según lo descrito por Racke⁷.
      NOTA: Al igual que la disminución del peso corporal, también es necesario un criterio de valoración humanitario para el aumento de las puntuaciones clínicas, de acuerdo con las directrices del comité institucional y de ética para el cuidado de los animales. En general, si un animal ya no es capaz de alimentarse por sí mismo de forma autónoma (esto suele ocurrir cuando un animal alcanza al menos la puntuación de 4, según la escala que utilicemos), debe ser sacrificado como aplicación del criterio de valoración humanitario.
4. Evaluación del rendimiento del motor mediante prueba de rotarod
   NOTA: La evaluación de la progresión de la EAE se suele realizar mediante la asignación diaria de la puntuación clínica, que es realizada por un investigador ciego totalmente entrenado. Sin embargo, podría ser útil complementarlo con una evaluación más cuantitativa y objetiva de la progresión de la enfermedad. En un estudio previo²⁶, se utilizó la prueba de rotarod para medir el rendimiento motor de los animales inmunizados. Como describen van den Berg et ^al.27, para tener una evaluación clínica más cuantitativa y precisa del curso de la enfermedad, la evaluación del rendimiento motor mediante la prueba de rotarod puede apoyar la evaluación de la puntuación clínica. Para una descripción detallada, véase van den Berg et ^al.27.
   1. Deje que los ratones se sometan a sesiones de rotarod diariamente, a partir de 1 ppp hasta el sacrificio (es decir, 28 ppp). Cada sesión consiste en una sola sesión de 300 s durante la cual la velocidad de la varilla debe aumentarse linealmente de 4 a 40 rpm.
   2. Registra la puntuación del animal. Cuando el mouse no es capaz de mantener el equilibrio y se cae del dispositivo, cae al suelo y activa un sensor, y se registra el tiempo (s). Por lo tanto, el rendimiento se puntúa como latencia para caer(es).

Grado	Signo clínico		Descripción
0	Sano		No se observó ningún signo clínico. El animal muestra un tono normal y movimiento de la cola. Camina sin tropezar.
0.5	Puerta deteriorada		El animal tropieza mientras camina sobre una parrilla.
1	Cola flácida		Cuando el animal es recogido por la base de la cola, la cola se cae (cola flácida).
1.5	Cola flácida y puerta dañada		El animal muestra una cola flácida y tropieza mientras camina sobre una parrilla.
2	Ataxia		El animal muestra dificultades para ponerse de pie una vez que se le ha dado la vuelta.
2.5	Ataxia y paresia de la extremidad posterior		El animal no puede ponerse de pie una vez que se ha volteado sobre su espalda, y pierde el tono de una de sus extremidades traseras.
3	Parálisis de las extremidades posteriores		El animal pierde el tono de ambas extremidades posteriores.
3.5	Parálisis de las extremidades posteriores y/o paresia de las extremidades anteriores		El animal pierde el tono de ambas extremidades posteriores y parcialmente de las extremidades anteriores. De hecho, muestra una pérdida de fuerza en el agarre de las extremidades anteriores.
4	Tetra paresia		El animal pierde por completo el tono de sus extremidades.
4.5	Tetra paresia y disminución de la temperatura corporal		El animal pierde por completo el tono de sus extremidades, y muestra una disminución de la temperatura corporal (hace frío).
5	Moribundo o muerto		El animal está moribundo (no responde a ningún estímulo) o muerto.

Tabla 2: Sistema de puntuación clínica utilizado para evaluar la evolución de la EAE.

4. Evaluación de los signos histopatológicos inducidos por EAE a nivel medular

NOTA: A continuación, informamos brevemente el procedimiento para sacrificar a los animales y recolectar la médula espinal para realizar análisis histopatológicos; Para una descripción detallada, consulte estas referencias 10,26,28,29.

1. Fijación y toma de muestras de tejidos
   NOTA: Para una descripción detallada, consulte estas referencias ^10,26.
   1. Sacrificar los animales a 28 dpi durante la fase crónica de la enfermedad.
      1. Anestesiar a los ratones mediante anestesia profunda irreversible (inyección intraperitoneal de Zolazepam y Tiletamina 80 mg/kg / Xilacina 10 mg/kg).
      2. Perfundir transcardialmente a los ratones con una solución salina seguida de una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%.
         NOTA: Preste atención al usar PFA: como es tóxico, evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos utilizando el equipo de protección personal adecuado. Pesar el polvo, preparar la solución y realizar la perfusión bajo la campana.
   2. Retire la médula espinal de la columna vertebral³⁰.
   3. Almacenar la médula espinal en una solución de PFA al 4% durante 24 h.
   4. Realizar varios lavados en tampón de fosfato salino (PBS) 0,01 M.
   5. Incrustar la médula espinal en bloques de parafina³⁰.
2. Procedimientos histológicos
   NOTA: Para una descripción detallada, véase Montarolo et ^al.10.
   1. Utilice un micrótomo para cortar secciones transversales de la médula espinal de 10 μm de grosor y recogerlas en portaobjetos recubiertos de gelatina. Oriente el plano de seccionamiento para que coincida con los dibujos correspondientes a las secciones transversales del atlas³¹ de la médula espinal del ratón.
   2. Realizar la desparafinación de los incisos³².
   3. Teñir la sección con hematoxilina y eosina³².
   4. Deshidratar las secciones³².
   5. Cubra las secciones con un medio de montaje y déjelas secar a temperatura ambiente bajo una cubierta química.
      NOTA: La tinción con hematoxilina-eosina permite detectar la presencia de infiltrados inflamatorios perivasculares (PvIIs)²⁶, lo que se evalúa como signo de la enfermedad²⁸.
3. Análisis cuantitativo de secciones de la médula espinal
   1. Adquiera imágenes de las secciones teñidas con un microscopio óptico conectado a una cámara digital con un objetivo 20x²⁹.
   2. Analice la imagen adquirida para obtener el número de PvIIs, expresado como el número de infiltrados por mm².
      NOTA: Para el análisis de las imágenes adquiridas, es útil aprovechar el software de análisis de imágenes. Los hallazgos neuropatológicos presentados en este trabajo se cuantifican en 10 cortes transversales completos de la médula espinal por ratón (n = 8/grupo) representativos de los niveles de toda la médula espinal.

Resultados

Seguimiento de EAE tras la inmunización
Esto se evaluó como se describe a continuación.

Peso corporal e ingesta de alimentos
El análisis de varianza de dos vías (ANOVA) (sexo y tiempo como variables independientes) muestra una disminución del peso corporal de los animales EAE de ambos sexos, especialmente dentro de la segunda semana post inducción (F_(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). S...

Discusión

El protocolo EAE inducido por MOG_35-55 que describimos condujo al desarrollo de una forma crónica de EM en ratones C57BL/6J ^7,8,13. En estos resultados representativos, reportamos que los animales de ambos sexos que se sometieron al procedimiento de inmunización desarrollaron una forma crónica de la enfermedad (es decir, no se recuperan completamente después del inicio de la enfermedad, acumulan déficits y mantie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic