Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Se caracteriza por una prevalencia diferente en los sexos, afectando más a las mujeres que a los hombres, y diferentes resultados, mostrando formas más agresivas en los hombres que en las mujeres. Además, la EM es muy heterogénea en cuanto a aspectos clínicos, características radiológicas y patológicas. Por lo tanto, es necesario aprovechar los modelos animales experimentales que permiten investigar la mayor cantidad posible de aspectos de la patología. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) representa uno de los modelos de EM más utilizados en ratones, modelando diferentes características de la enfermedad, desde la activación del sistema inmune hasta el daño en el SNC. En este trabajo describimos un protocolo para la inducción de EAE en ratones C57BL/6J machos y hembras mediante inmunización con el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG_35-55), que conduce al desarrollo de una forma crónica de la enfermedad. También informamos de la evaluación de la puntuación clínica diaria y el rendimiento motor de estos ratones durante 28 días después de la inmunización (28 dpi). Por último, ilustramos algunos análisis histológicos básicos a nivel del SNC, centrándonos en la médula espinal como el sitio primario de daño inducido por la enfermedad.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Muestra la presencia de infiltración perivascular de células inflamatorias, desmielinización, pérdida axonal y gliosis¹. Su etiología sigue siendo desconocida y sus aspectos clínicos, radiográficos y patológicos sugieren una notable heterogeneidad en la enfermedad².

Debido a su etiología y complejidad desconocidas, en la actualidad, ningún modelo animal recapitula todas las características clínicas y radiológicas mostradas en la EM humana ^3,4<....

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales en el presente trabajo se realizó de acuerdo con la Directiva del Consejo de la Unión Europea de 22^{de septiembre de} 2010 (2010/63/UE); todos los procedimientos relatados en el presente estudio fueron aprobados por el Ministerio de Salud italiano (407/2018-PR) y por el Comité de Ética de la Universidad de Turín (Proyecto n° 360384). Sugerimos ajustar el diseño experimental a las guías ARRIVE, publicadas originalmente por Kilkenny et al. en 2010²⁰. Antes de comenzar, asegúrese de que los materiales necesarios estén disponibles (consulte la tabla de materiales). Esterilizar toda la cr....

Resultados

Seguimiento de EAE tras la inmunización
Esto se evaluó como se describe a continuación.

Peso corporal e ingesta de alimentos
El análisis de varianza de dos vías (ANOVA) (sexo y tiempo como variables independientes) muestra una disminución del peso corporal de los animales EAE de ambos sexos, especialmente dentro de la segunda semana post inducción (F_(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). S.......

Discusión

El protocolo EAE inducido por MOG_35-55 que describimos condujo al desarrollo de una forma crónica de EM en ratones C57BL/6J ^7,8,13. En estos resultados representativos, reportamos que los animales de ambos sexos que se sometieron al procedimiento de inmunización desarrollaron una forma crónica de la enfermedad (es decir, no se recuperan completamente después del inicio de la enfermedad, acumulan déficits y mantie.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic