Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Riepilogo

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). È caratterizzata da una diversa prevalenza nei sessi, che colpisce più donne che uomini, e da esiti diversi, mostrando forme più aggressive negli uomini che nelle donne. Inoltre, la SM è altamente eterogenea in termini di aspetti clinici, caratteristiche radiologiche e patologiche. Pertanto, è necessario sfruttare modelli animali sperimentali che consentano di indagare il maggior numero possibile di aspetti della patologia. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta uno dei modelli più utilizzati di SM nei topi, modellando diverse caratteristiche della malattia, dall'attivazione del sistema immunitario al danno al SNC. Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di EAE in topi C57BL/6J sia maschi che femmine utilizzando l'immunizzazione con il peptide glicoproteico 35-55 (MOG_35-55) degli oligodendrociti mielinici, che porta allo sviluppo di una forma cronica della malattia. Riportiamo anche la valutazione del punteggio clinico giornaliero e delle prestazioni motorie di questi topi per 28 giorni dopo l'immunizzazione (28 dpi). Infine, illustriamo alcune analisi istologiche di base a livello del SNC, concentrandoci sul midollo spinale come sede primaria del danno indotto dalla malattia.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi¹. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia².

A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SM^{umana 3,4}. Tuttavia, vari modelli animali sono impiegati per studiare diversi aspetti della MS ^3,4. In questi modelli, l'inizio della malattia è in genere estremamente artificiale e il periodo di insorgenza dei segni clinici è diverso tra gli esseri umani e i topi. Ad esempio, nell'uomo, i processi fisiopatologici alla base della malattia non vengono rilevati per anni prima dell'insorgenza delle manifestazioni cliniche. Al contrario, gli sperimentatori possono rilevare i sintomi nei modelli animali entro settimane o addirittura giorni dopo l'induzione della SM⁴.

Tre modelli animali di base producono le caratteristiche della demielinizzazione che sono caratteristiche della SM: quelli indotti da virus (ad esempio, il virus dell'encefalomielite murina di Theiler), quelli indotti da agenti tossici (ad esempio, cuprizone, lisolecitina) e le diverse varianti dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)⁵. Ogni modello aiuta a studiare alcuni aspetti specifici della malattia, ma nessuno replica tutte le caratteristiche della SM⁶. Pertanto, è fondamentale scegliere il modello corretto considerando le specifiche esigenze sperimentali e le questioni scientifiche da affrontare.

Grazie alle procedure di immunizzazione contro gli antigeni derivati dalla mielina, l'EAE è indotta dall'innesco di una risposta autoimmune ai componenti del SNC nei topi predisposti. L'interazione tra un'ampia gamma di meccanismi immunopatologici e neuropatologici provoca lo sviluppo dei principali tratti patologici della SM (cioè infiammazione, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi) nei topi immunizzati ^7,8. I topi iniziano a mostrare sintomi clinici intorno alla seconda settimana dopo l'immunizzazione e generalmente mostrano una paralisi ascendente dalla coda all'arto e all'arto anteriore. Il punteggio clinico (cioè la quantificazione dell'accumulo di deficit correlati alla malattia) è generalmente valutato utilizzando una scala a 5 punti⁷.

L'immunizzazione attiva con proteine o peptidi o il trasferimento passivo di cellule T encefalitogene possono essere utilizzate per indurre EAE in topi con diversi background genetici (ad esempio, SJL/J, C57BL/6 e topi non obesi-diabetici (NOD)). La proteina proteolipidica della mielina (PLP), la proteina basica della mielina (MBP) e la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) sono esempi di proteine del sistema nervoso centrale da cui vengono solitamente prodotti gli immunogeni. In particolare, i topi SJL/J immunizzati con l'epitopo immunodominante di PLP (PLP_139−151) sviluppano un decorso di malattia recidivante-remittente (RR), mentre i topi C57BL/6J immunizzati con il peptide immunodominante MOG_35-55 mostrano EAE di natura cronica¹. Nonostante alcune limitazioni, come la scarsità di informazioni sulla progressione della SM, il ruolo delle cellule B nella malattia, i meccanismi inside-out o le difficoltà nello studio della rimielinizzazione, i modelli EAE hanno contribuito enormemente alla comprensione dei processi autoimmuni e neuroinfiammatori, aumentando le conoscenze nel campo della SM e consentendo così lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per questa malattia^{4, 6}. Introduzione

Nel presente lavoro, ci siamo concentrati su una particolare forma di EAE attivo, la forma^indotta dal peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55 (MOG_35-55) 9,10,11,12. L'EAE indotta da MOG_35-55 modella una forma cronica di SM. Dopo l'immunizzazione, i topi vanno incontro a una fase asintomatica entro la prima settimana dopo l'immunizzazione, quindi la malattia insorge tipicamente durante la seconda settimana dopo l'immunizzazione, mentre tra la terza e la quarta settimana dopo l'immunizzazione, la malattia diventa cronica, senza possibilità di pieno recupero dai deficit accumulati ^7,8,13. È interessante notare che nella maggior parte degli studi presenti^{in letteratura non} si osservano differenze tra maschi e femmine in termini di incidenza, insorgenza della malattia, decorso o progressione, anche se un numero inferiore di studi confronta la malattia nei maschi e nelle femmine.

Al contrario, negli esseri umani, questi parametri sono noti per essere fortemente dimorfici sessualmente². La sclerosi multipla colpisce più le donne che gli uomini; Tuttavia, gli uomini generalmente sviluppano una forma più aggressiva della malattia². Queste evidenze hanno suggerito un ruolo essenziale, oltre che complesso, degli ormoni gonadici¹⁵; Tuttavia, il ruolo e il meccanismo d'azione degli ormoni sessuali nella patologia rimangono poco chiari. Inoltre, i dati provenienti da modelli animali supportano l'idea che sia gli estrogeni che gli androgeni esercitino effetti positivi su diversi tratti della patologia in modo sesso-specifico ^16,17.

Alcuni studi suggeriscono anche effetti neuroprotettivi, promielinizzanti e antinfiammatori del progesterone¹⁸ e, sebbene le prove nei pazienti con SM siano scarse¹⁸, gli steroidi neuroattivi (cioè steroidi sintetizzati de novo dal sistema nervoso, come il pregnenolone, il tetraidroprogesterone e il diidroprogesterone) potrebbero anche influenzare il decorso patologico¹⁹. Collettivamente, questi dati supportano l'idea che gli ormoni sessuali prodotti sia perifericamente che all'interno del sistema nervoso centrale abbiano un ruolo importante e specifico per sesso nell'insorgenza e nella progressione della malattia. Pertanto, nel presente lavoro, sollecitiamo la raccolta di dati separati da animali maschi e femmine.

Dal punto di vista istopatologico, la sostanza bianca del midollo spinale funge da sito principale di lesione del SNC in questo modello, che è caratterizzato da regioni multifocali e confluenti di infiltrazione infiammatoria mononucleare e demielinizzazione⁸. Pertanto, nel descrivere questo protocollo per l'induzione di EAE indotta da MOG_35-55 in topi C57BL/6J, prenderemo in considerazione l'esito della malattia nei due sessi e forniremo alcune informazioni istopatologiche riguardanti il midollo spinale.

Protocollo

La cura e la movimentazione degli animali nel presente lavoro è stata eseguita secondo la Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22^settembre 2010 (2010/63/UE); tutte le procedure riportate nel presente studio sono state approvate dal Ministero della Salute (407/2018-PR) e dal Comitato Etico dell'Università di Torino (Progetto n° 360384). Suggeriamo di conformarsi al disegno sperimentale alle linee guida ARRIVE originariamente pubblicate da Kilkenny et al. nel 2010²⁰. Prima di iniziare, assicurarsi che siano disponibili i materiali necessari (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare in autoclave tutta la vetreria e gli utensili utilizzati per la preparazione dell'emulsione MOG_35-55 . Una sintesi delle procedure sperimentali è rappresentata nella Figura 1.

1. Preparazione dell'emulsione MOG_35-55

NOTA: Per preparare l'emulsione sono necessari MOG_35-55, adiuvante di Freud incompleto (IFA), Mycobacterium Tuberculosis ceppo H37Ra (MT) e soluzione fisiologica (vedi Tabella dei materiali).

ATTENZIONE: La MT uccisa dal calore può stimolare la risposta immunitaria innata. Evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e pesando MT in una bilancia di precisione coperta sotto il cofano.

Soluzione	Composizione	Note
2 mg/mL di soluzione peptidica MOG35-55	Peptide MOG35-55 liofilizzato diluito in soluzione fisiologica alla concentrazione di 2 mg/mL	Conservare la soluzione già diluita a -80 °C.
Soluzione PT 5 μg/mL	PT liofilizzato diluito in soluzione fisiologica alla concentrazione di 5 μg/mL.	Conservare la soluzione già diluita a -80 °C.
Emulsione	Il volume totale di emulsione necessario per ciascun topo da immunizzare è di 300 μL così suddiviso:	Per evitare alterazioni o contaminazioni, preparare l'emulsione il giorno dell'immunizzazione.
	200 μg/topo di MOG35-55 , cioè 100 μL di MOG35-55 2 mg/mL di soluzione.
	50 μL di soluzione fisiologica
	150 μL di IFA
	4 mg/mL MT, cioè 1,2 mg/topo
Soluzione fisiologica	Cloruro di sodio 0,9% diluito in acqua distillata.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate per la procedura di immunizzazione.

1. Preparare la soluzione in un becher di vetro, aggiungendo prima la componente liquida e infine il MT.
   NOTA: Il volume totale di emulsione necessario per ciascun topo da immunizzare è di 300 μL, suddiviso come indicato nella Tabella 1. L'emulsione è molto viscosa e densa, quindi durante la procedura di preparazione e iniezione, potrebbe esserci qualche perdita, soprattutto quando si prepara la soluzione per alcuni topi. Suggeriamo di calcolare il volume finale di emulsione necessario sovrastimando il numero di topi da immunizzare di almeno 1,5-2 volte.
2. Immergere il becher nel ghiaccio e utilizzare la siringa di vetro con un ago da 18 G per iniziare ad emulsionare la soluzione.
   NOTA: L'emulsione può essere preparata anche utilizzando altre strategie, ad esempio collegando le due siringhe di vetro air-free con un rubinetto a tre vie e mescolando la soluzione spingendo avanti e indietro gli stantuffi^21,22.
3. Emulsionare la soluzione per almeno 15 min; Generalmente, 30 minuti di emulsione sono sufficienti. Per verificare la qualità dell'emulsione, aggiungere una goccia di emulsione in un contenitore trasparente riempito d'acqua: se la goccia mantiene la sua struttura e rimane intatta, l'emulsione è pronta.
4. Posizionare l'emulsione direttamente all'interno delle siringhe da 1 mL che verranno utilizzate per l'immunizzazione e conservarle a +4 °C fino al momento dell'utilizzo per preservare lo spessore dell'emulsione ed evitare alterazioni o contaminazioni.

2. Selezione e immunizzazione degli animali

1. Selezione degli animali
   1. Selezionare topi adulti C57BL/6J di entrambi i sessi a 8-10 settimane di età con un peso corporeo ottimale di ~20 g. Assicurati di selezionare topi abbinati per età e sesso per diversi gruppi sperimentali perché la suscettibilità alla malattia può variare con l'età e il sesso.
      NOTA: I topi dovrebbero avere un peso corporeo comparabile il giorno dell'immunizzazione perché la presente procedura è ottimizzata per un certo intervallo di peso corporeo (17-25 g).
   2. Alloggiare animali dello stesso sesso in gruppi (n = 4-5/gabbia) per evitare l'isolamento sociale in condizioni standard in gabbie per topi in polipropilene da 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, con ciclo luce/buio inferiore alle 12:12 (luci accese alle 08:00). Fornire cibo e acqua ad libitum.
      NOTA: Infine, per limitare ulteriormente la potenziale variabilità del decorso della malattia negli animali immunizzati, suggeriamo anche di formare gruppi sperimentali sufficientemente numerosi. Ci sono anche studi ^8,23 che descrivono la tempistica dell'immunizzazione come una condizione che determina la variazione dell'esito dell'EAE. Pertanto, suggeriamo di eseguire l'immunizzazione approssimativamente alla stessa ora in tutti gli animali, preferibilmente durante le ore di luce del ciclo giorno/buio²³. Per limitare lo stress, è preferibile manipolare gli animali prima del giorno dell'immunizzazione e contrassegnarli per identificarli facilmente per la valutazione quotidiana, ad esempio ritagliando le orecchie o etichettandole.
2. La procedura di immunizzazione
   NOTA: Assicurarsi che la procedura sia eseguita da uno sperimentatore esperto per ridurre al minimo lo stress per gli animali e ottimizzare l'immunizzazione. Prima di iniziare l'immunizzazione, selezionare il metodo di anestesia in conformità con le linee guida del comitato etico e di cura degli animali istituzionali. Il nostro laboratorio utilizza l'anestesia breve con isoflurano.
   1. Anestetizzare il topo: isoflurano al 4% per l'induzione dell'anestesia e isoflurano all'1,5-2% per il mantenimento dell'anestesia. Attendere che l'anestesia sia efficace e utilizzare un pizzico di dita del piede posteriore e anteriore per valutare il livello di anestesia. Per prevenire la secchezza degli occhi mentre il topo è sotto anestesia, utilizzare un unguento per gli occhi approvato dal veterinario.
   2. Iniezione endovenosa PT nella vena caudale laterale: tappare delicatamente la coda del topo con una soluzione di etanolo, che funge da vasodilatatore, per visualizzare le vene. Mettere a fuoco una delle due nervature laterali della coda e, utilizzando una siringa da 0,5 mL dotata di un ago da 30 G, iniettare 500 ng di PT (cioè 100 μL di PT diluiti in soluzione fisiologica alla concentrazione di 5 μg/mL).
   3. Iniezione sottocutanea dell'emulsione MOG_35-55 : utilizzando la siringa da 1 mL con ago da 26 G, eseguire tre iniezioni sottocutanee dell'emulsione precedentemente preparata: due sotto la parte rostrale dei fianchi e una alla base della coda. Il volume di emulsione iniettato in ciascun sito è di 100 μL, per un volume totale di 300 μL di emulsione iniettata in ciascun topo.
      NOTA: Il giorno dell'immunizzazione viene registrato come giorno 0 dopo l'immunizzazione (dpi); 48 ore dopo (cioè a 2 dpi), è necessario eseguire un'altra iniezione endovenosa di PT uguale a quella precedentemente eseguita. È possibile eseguire l'iniezione senza anestesia, utilizzando un sistema di ritenuta per topi. La procedura qui descritta ha lo scopo di indurre e mantenere l'anestesia dei topi durante la procedura di immunizzazione per evitare possibili disagi e movimenti degli animali o rischi sia per i topi che per gli sperimentatori. Pertanto, non ci sono procedure chirurgiche. Tuttavia, per ottimizzare i processi sperimentali, è importante mantenere condizioni di sterilità appropriate durante queste fasi e monitorare le condizioni del topo dopo queste procedure.
   4. Per verificare che il topo si sia ripreso dalle iniezioni, metterlo in una gabbia pulita dopo le procedure e attendere che abbia ripreso conoscenza a sufficienza per mantenere il decubito sternale. Dopo che il topo si è completamente ripreso, rimettilo nella gabbia di casa con altri animali.

3. Follow-up dell'EAE

1. Peso corporeo e assunzione di cibo
   1. Monitorare quotidianamente il peso corporeo (BW) degli animali, utilizzando una bilancia elettronica di precisione, perché la diminuzione del peso corporeo è un indicatore della progressione della malattia.
      NOTA: Questa diminuzione non deve superare una certa percentuale, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Di solito, se un animale perde più del 20% del peso corporeo iniziale (cioè il peso registrato a 0 dpi), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano. I metodi di eutanasia prevedono l'anestesia profonda irreversibile per inalazione (ad esempio, isoflurano al 5%) seguita da decapitazione.
   2. Monitorare l'assunzione di cibo (FI) - il cibo consumato da un animale in un giorno (g∙^giorno-1∙^animale-1), pesando la quantità di cibo nell'apposito contenitore almeno una volta alla settimana, e dividendo la quantità di cibo consumato per i giorni trascorsi tra due misurazioni sequenziali e il numero di animali presenti nella gabbia.
      NOTA: Questa misurazione consente di stimare l'assunzione media di cibo. A causa della comparsa e dell'accumulo di segni clinici di malattia, che comportano la paralisi degli arti, si consiglia di posizionare del cibo annaffiato sul pavimento della gabbia quando gli animali non sono in grado di stare saldamente in piedi sugli arti posteriori e raggiungere il contenitore del cibo o la bottiglia d'acqua. Per valutare l'assunzione di cibo durante il periodo di follow-up nel modo più preciso possibile, abbiamo anche misurato il peso secco di questo alimento prima di bagnarlo per i topi.
2. Valutazione della ciclicità estrale durante l'EAE
   1. Controllare il ciclo estrale per almeno due cicli, valutando gli strisci citologici vaginali come descritto da McLean et ^al.24. Classificare la fase del ciclo estrale in base alla presenza di tre tipi di cellule primarie - cellule epiteliali nucleate, cellule epiteliali squamose cornificate e leucociti - nei campioni di striscio vaginale, come segue:
      1. Classificare come proestro in base alla presenza quasi esclusiva di gruppi di cellule epiteliali nucleate rotonde e ben formate.
      2. Classificare come estro in base alla presenza predominante di ammassi densamente impacchettati di cellule epiteliali squamose cornificate.
      3. Classificare come metestro in base alla presenza predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e alla minore presenza di cellule epiteliali squamose cornificate.
      4. Classificazione come diestro in base alla presenza altamente predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e rare cellule epiteliali squamose cornificate insieme alla possibile comparsa di cellule epiteliali nucleate.
         NOTA: Quando si valuta la malattia in entrambi i sessi, è importante verificare la variabilità nelle femmine dovuta al ciclo estrale. Suggeriamo di concentrarsi sulla valutazione del ciclo estrale, soprattutto tra la prima e la seconda settimana dopo l'immunizzazione (cioè durante la fase acuta dell'EAE). È stato precedentemente dimostrato che la procedura di immunizzazione provoca le alterazioni più pronunciate del ciclo estrale all'interno di questa fase²⁵. Inoltre, è importante considerare che l'esecuzione dello striscio quando l'animale raggiunge un punteggio clinico elevato (soprattutto >3) è difficoltosa a causa della paresi posteriore e della mancanza di tono negli arti posteriori.
3. Punteggio clinico
   1. Chiedere a uno sperimentatore in cieco di valutare quotidianamente il punteggio clinico degli animali. Assegnare a ciascun animale un punteggio da 0 a 5 (vedere Tabella 2) per valutare il decorso della malattia²⁶ come descritto da Racke⁷.
      NOTA: Analogamente alla diminuzione del peso corporeo, è necessario anche un endpoint umano per l'aumento dei punteggi clinici, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Generalmente, se un animale non è più in grado di nutrirsi autonomamente (questo di solito accade quando un animale raggiunge almeno il punteggio di 4, secondo la scala che utilizziamo), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano.
4. Valutazione delle prestazioni del motore mediante test rotarod
   NOTA: La valutazione della progressione dell'EAE viene solitamente eseguita assegnando il punteggio clinico giornalmente, che viene eseguito da uno sperimentatore in cieco completamente addestrato. Tuttavia, potrebbe essere utile affiancarla a una valutazione più quantitativa e oggettiva della progressione della malattia. In un precedente studio²⁶, il test rotarod è stato utilizzato per misurare le prestazioni motorie degli animali immunizzati. Come descritto da van den Berg et ^al.27, per avere una valutazione clinica più quantitativa e precisa del decorso della malattia, la valutazione delle prestazioni motorie mediante il test rotarod può supportare la valutazione del punteggio clinico. Per una descrizione dettagliata, vedi van den Berg et ^al.27.
   1. Lascia che i topi si sottopongano a sessioni di rotarod ogni giorno, a partire da 1 dpi fino al sacrificio (cioè 28 dpi). Ogni sessione consiste in una singola sessione di 300 s durante la quale la velocità dell'asta deve essere aumentata linearmente da 4 a 40 giri/min.
   2. Registra il punteggio dell'animale. Quando il mouse non è in grado di mantenere l'equilibrio e cade dal dispositivo, cade a terra e attiva un sensore e viene registrato il tempo o i tempi. Pertanto, le prestazioni vengono valutate come latenza per cadere (s).

Grado	Segni clinici		Descrizione
0	Sano		Nessun segno clinico osservato. L'animale mostra un tono normale e il movimento della coda. Cammina senza inciampare.
0.5	Cancello danneggiato		L'animale inciampa mentre cammina su una griglia.
1	Coda floscia		Quando l'animale viene afferrato per la base della coda, la coda si abbassa (coda flaccida).
1.5	Coda floscia e cancello compromesso		L'animale mostra una coda flaccida e inciampa mentre cammina su una griglia.
2	Atassia		L'animale mostra difficoltà a stare in piedi una volta girato sul dorso.
2.5	Atassia e paresi degli arti posteriori		L'animale non può stare in piedi una volta che è stato girato sulla schiena e perde il tono di uno dei suoi arti posteriori.
3	Paralisi degli arti posteriori		L'animale perde il tono di entrambi gli arti posteriori.
3.5	Paralisi degli arti posteriori e/o paresi degli arti anteriori		L'animale perde il tono di entrambi gli arti posteriori e parzialmente degli arti anteriori. Infatti, mostra una perdita di forza nella presa degli arti anteriori.
4	Tetra paresi		L'animale perde completamente il tono delle sue membra.
4.5	Tetraparesi e diminuzione della temperatura corporea		L'animale perde completamente il tono degli arti e mostra una diminuzione della temperatura corporea (ha freddo).
5	Morire o morire		L'animale sta morendo (non risponde a nessuno stimolo) o è morto.

Tabella 2: Sistema di punteggio clinico utilizzato per valutare la progressione dell'EAE.

4. Valutazione dei segni istopatologici indotti da EAE a livello del midollo spinale

NOTA: Di seguito, riportiamo brevemente la procedura per sacrificare gli animali e prelevare il midollo spinale per eseguire l'analisi istopatologica; Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti 10,26,28,29.

1. Fissazione e prelievo di tessuti
   NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti^10,26.
   1. Sacrificare gli animali a 28 dpi durante la fase cronica della malattia.
      1. Anestetizzare i topi mediante anestesia profonda irreversibile (iniezione intraperitoneale di Zolazepam e Tiletamina 80 mg/kg / Xilazina 10 mg/kg).
      2. Perfondere per via transcardiaca i topi con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%.
         NOTA: Prestare attenzione durante l'utilizzo del PFA: poiché è tossico, evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Pesare la polvere, preparare la soluzione ed eseguire la perfusione sotto il cofano.
   2. Rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale³⁰.
   3. Conservare il midollo spinale in una soluzione di PFA al 4% per 24 ore.
   4. Eseguire diversi lavaggi in tampone fosfato salino (PBS) da 0,01 M.
   5. Incorporare il midollo spinale in blocchi di paraffina³⁰.
2. Procedure istologiche
   NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere Montarolo et ^al.10.
   1. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni trasversali del midollo spinale spesse 10 μm e raccoglierle su vetrini rivestiti di gelatina. Orientare il piano di sezionamento in modo che corrisponda ai disegni corrispondenti alle sezioni trasversali dell'atlante del midollo spinale del topo³¹.
   2. Eseguire la deparaffinizzazione delle sezioni³².
   3. Colorare la sezione con ematossilina ed eosina³².
   4. Disidratare le sezioni³².
   5. Coprire le sezioni con un mezzo di montaggio e lasciarle asciugare a temperatura ambiente sotto una cappa chimica.
      NOTA: La colorazione ematossilina-eosina consente di rilevare la presenza degli infiltrati infiammatori perivascolari (PvII)²⁶, che viene valutata come segno della malattia²⁸.
3. Analisi quantitativa delle sezioni del midollo spinale
   1. Acquisire le immagini delle sezioni colorate con un microscopio ottico collegato a una fotocamera digitale con obiettivo 20x²⁹.
   2. Analizzare l'immagine acquisita per ottenere il numero di PvII, espresso come numero di infiltrati per mm².
      NOTA: Per l'analisi delle immagini acquisite è utile avvalersi di software di analisi delle immagini. I risultati neuropatologici presentati in questo lavoro sono quantificati in 10 sezioni trasversali complete del midollo spinale per topo (n = 8/gruppo) rappresentative dei livelli dell'intero midollo spinale.

Risultati

Follow-up dell'EAE dopo l'immunizzazione
Questo è stato valutato come descritto di seguito.

Peso corporeo e assunzione di cibo
L'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una diminuzione del peso corporeo degli animali EAE di entrambi i sessi, soprattutto entro la seconda settimana dopo l'induzione (F_(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). Tut...

Discussione

Il protocollo EAE indotto da MOG_35-55 che abbiamo descritto ha portato allo sviluppo di una forma cronica di SM nei topi C57BL/6J ^7,8,13. In questi risultati rappresentativi, abbiamo riportato che gli animali di entrambi i sessi che sono stati sottoposti alla procedura di immunizzazione hanno sviluppato una forma cronica della malattia (cioè, non si riprendono completamente dopo l'insorgenza della malattia, accumulan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic