Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Riepilogo

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). È caratterizzata da una diversa prevalenza nei sessi, che colpisce più donne che uomini, e da esiti diversi, mostrando forme più aggressive negli uomini che nelle donne. Inoltre, la SM è altamente eterogenea in termini di aspetti clinici, caratteristiche radiologiche e patologiche. Pertanto, è necessario sfruttare modelli animali sperimentali che consentano di indagare il maggior numero possibile di aspetti della patologia. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta uno dei modelli più utilizzati di SM nei topi, modellando diverse caratteristiche della malattia, dall'attivazione del sistema immunitario al danno al SNC. Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di EAE in topi C57BL/6J sia maschi che femmine utilizzando l'immunizzazione con il peptide glicoproteico 35-55 (MOG_35-55) degli oligodendrociti mielinici, che porta allo sviluppo di una forma cronica della malattia. Riportiamo anche la valutazione del punteggio clinico giornaliero e delle prestazioni motorie di questi topi per 28 giorni dopo l'immunizzazione (28 dpi). Infine, illustriamo alcune analisi istologiche di base a livello del SNC, concentrandoci sul midollo spinale come sede primaria del danno indotto dalla malattia.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi¹. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia².

A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SM^{umana 3,4}....

Protocollo

La cura e la movimentazione degli animali nel presente lavoro è stata eseguita secondo la Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22^settembre 2010 (2010/63/UE); tutte le procedure riportate nel presente studio sono state approvate dal Ministero della Salute (407/2018-PR) e dal Comitato Etico dell'Università di Torino (Progetto n° 360384). Suggeriamo di conformarsi al disegno sperimentale alle linee guida ARRIVE originariamente pubblicate da Kilkenny et al. nel 2010²⁰. Prima di iniziare, assicurarsi che siano disponibili i materiali necessari (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare in autoclave tutta la vet....

Discussione

Il protocollo EAE indotto da MOG_35-55 che abbiamo descritto ha portato allo sviluppo di una forma cronica di SM nei topi C57BL/6J ^7,8,13. In questi risultati rappresentativi, abbiamo riportato che gli animali di entrambi i sessi che sono stati sottoposti alla procedura di immunizzazione hanno sviluppato una forma cronica della malattia (cioè, non si riprendono completamente dopo l'insorgenza della malattia, accumulan.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic