Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Resumo

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Caracteriza-se por diferentes prevalências entre os sexos, acometendo mais mulheres do que homens, e desfechos diferentes, mostrando formas mais agressivas em homens do que em mulheres. Além disso, a EM é altamente heterogênea em termos de aspectos clínicos, radiológicos e patológicos. Assim, faz-se necessário o aproveitamento de modelos experimentais animais que permitam a investigação do maior número possível de aspectos da patologia. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) representa um dos modelos de EM mais utilizados em camundongos, modelando diferentes características da doença, desde a ativação do sistema imune até danos ao SNC. Descrevemos aqui um protocolo para a indução de EAE em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas usando imunização com o peptídeo glicoproteico 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55), que leva ao desenvolvimento de uma forma crônica da doença. Relatamos também a avaliação do escore clínico diário e do desempenho motor desses camundongos durante 28 dias pós-imunização (28 dpi). Finalmente, ilustramos algumas análises histológicas básicas em nível do SNC, enfocando a medula espinhal como o sítio primário de dano induzido pela doença.

Introdução

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Mostra a presença de infiltração perivascular de células inflamatórias, desmielinização, perda axonal e gliose¹. Sua etiologia permanece desconhecida e seus aspectos clínicos, radiográficos e patológicos sugerem notável heterogeneidade na^doença2.

Devido à sua etiologia e complexidade desconhecidas, até o momento, nenhum modelo animal recapitula todas as características clínicas e radiológicas apresentadas na EM humana ^3,4. N....

Protocolo

Os cuidados e manejo dos animais no presente trabalho foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho da União Europeia de 22^{de setembro de} 2010 (2010/63/UE); todos os procedimentos relatados no presente estudo foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (407/2018-PR) e pelo Comitê de Ética da Universidade de Torino (Projeto n° 360384). Sugerimos adequar o desenho experimental às diretrizes ARRIVE originalmente publicadas por Kilkenny et al., em 2010²⁰. Antes de começar, certifique-se de que os materiais necessários estão disponíveis (consulte a Tabela de Materiais). Esterilizar todos os utensílios e vidr....

Discussão

O protocolo de EAE induzido por MOG_35-55 que descrevemos levou ao desenvolvimento de uma forma crônica de EM em camundongos C57BL/6J7,8,13. Nesses resultados representativos, relatamos que os animais de ambos os sexos submetidos ao procedimento de imunização desenvolveram uma forma crônica da doença (ou seja, não se recuperam totalmente após o início da doença, acumulam déficits e mantêm um EC de pelo menos.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic