Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Resumo

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Caracteriza-se por diferentes prevalências entre os sexos, acometendo mais mulheres do que homens, e desfechos diferentes, mostrando formas mais agressivas em homens do que em mulheres. Além disso, a EM é altamente heterogênea em termos de aspectos clínicos, radiológicos e patológicos. Assim, faz-se necessário o aproveitamento de modelos experimentais animais que permitam a investigação do maior número possível de aspectos da patologia. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) representa um dos modelos de EM mais utilizados em camundongos, modelando diferentes características da doença, desde a ativação do sistema imune até danos ao SNC. Descrevemos aqui um protocolo para a indução de EAE em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas usando imunização com o peptídeo glicoproteico 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55), que leva ao desenvolvimento de uma forma crônica da doença. Relatamos também a avaliação do escore clínico diário e do desempenho motor desses camundongos durante 28 dias pós-imunização (28 dpi). Finalmente, ilustramos algumas análises histológicas básicas em nível do SNC, enfocando a medula espinhal como o sítio primário de dano induzido pela doença.

Introdução

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Mostra a presença de infiltração perivascular de células inflamatórias, desmielinização, perda axonal e gliose¹. Sua etiologia permanece desconhecida e seus aspectos clínicos, radiográficos e patológicos sugerem notável heterogeneidade na^doença2.

Devido à sua etiologia e complexidade desconhecidas, até o momento, nenhum modelo animal recapitula todas as características clínicas e radiológicas apresentadas na EM humana ^3,4. No entanto, vários modelos animais são empregados para estudar diferentes aspectos da SM ^3,4. Nesses modelos, o início da doença é tipicamente extremamente artificial, e o período de tempo do início dos sinais clínicos é diferente entre humanos e camundongos. Por exemplo, em humanos, os processos fisiopatológicos subjacentes à doença não são detectados por anos antes do início das manifestações clínicas. Por outro lado, os experimentadores podem detectar sintomas em modelos animais dentro de semanas ou até dias após a indução da SM⁴.

Três modelos animais básicos produzem as características da desmielinização características da EM: os induzidos por vírus (por exemplo, o vírus da encefalomielite murina de Theiler), os induzidos por agentes tóxicos (por exemplo, cuprizona, lisolecitina) e as diferentes variantes da encefalomielite autoimune experimental (EAE)⁵. Cada modelo ajuda a estudar algumas facetas específicas da doença, mas nenhuma replica todas as características da EM⁶. Assim, é fundamental a escolha do modelo correto considerando as necessidades experimentais específicas e as questões científicas a serem abordadas.

Graças aos procedimentos de imunização contra antígenos derivados da mielina, o EAE é induzido pelo desencadeamento de uma resposta autoimune aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis. A interação entre uma ampla gama de mecanismos imunopatológicos e neuropatológicos causa o desenvolvimento das principais características patológicas da EM (isto é, inflamação, desmielinização, perda axonal e gliose) nos camundongos imunizados ^7,8. Os camundongos começam a apresentar sintomas clínicos por volta da segunda semana após a imunização e geralmente apresentam paralisia ascendente da cauda para o membro e membro anterior. O escore clínico (isto é, a quantificação do acúmulo de déficits relacionados à doença) é geralmente avaliado por meio de uma escala de 5^pontos7.

A imunização ativa com proteína ou peptídeo ou a transferência passiva de células T encefalitogênicas podem ser usadas para induzir EAE em camundongos com diferentes origens genéticas (por exemplo, SJL/J, C57BL/6 e camundongos não obesos-diabéticos (NOD). A proteína proteolipídica da mielina (PLP), a proteína básica da mielina (MBP) e a glicoproteína oligodendrócita da mielina (MOG) são exemplos de proteínas do auto-SNC a partir das quais os imunógenos são usualmente produzidos. Particularmente, camundongos SJL/J imunizados com o epítopo imunodominante de PLP (PLP_139−151) desenvolvem um curso de doença remitente-recorrente (RR), enquanto camundongos C57BL/6J imunizados com o peptídeo MOG_35-55 imunodominante apresentam EAE de natureza crônica¹. Apesar de algumas limitações, como fornecer poucas informações sobre a progressão da SM, o papel das células B na doença, os mecanismos de dentro para fora ou dificuldades no estudo da remielinização, os modelos EAE têm contribuído enormemente para a compreensão dos processos autoimunes e neuroinflamatórios, aumentando o conhecimento no campo da EM e, assim, permitindo o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essa doença^{4, 6º}.

No presente trabalho, focamos em uma forma particular de EAE ativo, a forma induzida pelo peptídeo glicoproteico 35-55 (MOG_35-55) 9,10,11,12. O EAE induzido pelo MOG_35-55 modela uma forma crônica de EM. Após a imunização, os camundongos passam por uma fase assintomática na primeira semana após a imunização, então a doença geralmente surge durante a segunda semana após a imunização, enquanto entre a terceira e a quarta semanas após a imunização, a doença torna-se crônica, sem possibilidade de recuperação completa dos déficits acumulados ^7,8,13. Curiosamente, não há diferenças entre homens e mulheres na incidência, início, curso ou progressão da doença na maioria dos estudos presentes na^literatura14, mesmo que menos estudos comparem a doença em homens e mulheres.

Em contraste, em humanos, esses parâmetros são conhecidos por serem fortemente dimórficos^sexualmente2. A SM afeta mais mulheres do que homens; no entanto, os homens geralmente desenvolvem uma forma mais agressiva da doença². Essas evidências sugerem um papel essencial, bem como complexo, dos hormônios gonadais¹⁵; No entanto, o papel e o mecanismo de ação dos hormônios sexuais na patologia permanecem obscuros. Além disso, dados de modelos animais apoiam a ideia de que tanto estrógenos quanto andrógenos exercem efeitos positivos em diferentes tratos da patologia de forma específica por sexo^16,17.

Alguns estudos também sugerem efeitos neuroprotetores, promielinizantes e anti-inflamatórios da progesterona¹⁸ e, embora as evidências em pacientes com EM sejam escassas¹⁸, esteroides neuroativos (ou seja, esteroides sintetizados de novo pelo sistema nervoso, como pregnenolona, tetrahidroprogesterona e diidroprogesterona) também podem afetar o curso patológico¹⁹. Coletivamente, esses dados apoiam a ideia de que os hormônios sexuais produzidos tanto perifericamente quanto dentro do SNC têm um papel importante e específico do sexo no início e progressão da doença. Portanto, no presente trabalho, pedimos a coleta de dados separados de animais machos e fêmeas.

Do ponto de vista histopatológico, a substância branca da medula espinhal é o principal sítio de lesão do SNC nesse modelo, que se caracteriza por regiões multifocais e confluentes de infiltrado inflamatório mononuclear e desmielinização8. Assim, ao descrever este protocolo para a indução de EAE induzida por MOG_35-55 em camundongos C57BL/6J, levaremos em consideração o desfecho da doença nos dois sexos e forneceremos alguns insights histopatológicos em relação à medula espinhal.

Protocolo

Os cuidados e manejo dos animais no presente trabalho foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho da União Europeia de 22^{de setembro de} 2010 (2010/63/UE); todos os procedimentos relatados no presente estudo foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (407/2018-PR) e pelo Comitê de Ética da Universidade de Torino (Projeto n° 360384). Sugerimos adequar o desenho experimental às diretrizes ARRIVE originalmente publicadas por Kilkenny et al., em 2010²⁰. Antes de começar, certifique-se de que os materiais necessários estão disponíveis (consulte a Tabela de Materiais). Esterilizar todos os utensílios e vidrarias utilizados para a preparação da emulsão MOG_35-55 em autoclave. Um resumo dos procedimentos experimentais está representado na Figura 1.

1. Preparação da emulsão MOG_35-55

NOTA: Para preparar a emulsão, MOG_35-55, adjuvante de Freud incompleto (RIFI), cepa H37Ra (MT) de Mycobacterium tuberculosis e solução fisiológica são necessários (ver Tabela de Materiais).

CUIDADO: MT morto pelo calor pode estimular a resposta imune inata. Evite inalação, ingestão e contato com a pele e os olhos usando equipamentos de proteção individual adequados e pesando MT em uma balança de precisão coberta sob o capô.

Solução	Composição	Anotações
2 mg/mL MOG35-55 solução peptídica	Peptídeo MOG35-55 liofilizado diluído em solução fisiológica na concentração de 2 mg/mL	Conservar a solução já diluída a -80 °C.
5 μg/mL de solução de TP	TP liofilizado diluído em solução fisiológica na concentração de 5 μg/mL.	Conservar a solução já diluída a -80 °C.
Emulsão	O volume total de emulsão necessário para cada camundongo a ser imunizado é de 300 μL dividido da seguinte forma:	Para evitar alterações ou contaminação, prepare a emulsão no dia da imunização.
	200 μg/camundongo de MOG35-55 , ou seja, 100 μL de MOG35-55 2 mg/mL de solução.
	50 μL de solução fisiológica
	150 μL de IFA
	4 mg/mL MT, ou seja, 1,2 mg/camundongo
Solução fisiológica	Cloreto de sódio a 0,9% diluído em água destilada.

Tabela 1: Composição das soluções utilizadas para o procedimento de imunização.

1. Prepare a solução em um copo de vidro, adicionando primeiro o componente líquido e, finalmente, o MT.
   OBS: O volume total de emulsão necessário para cada camundongo a ser imunizado é de 300 μL, dividido conforme indicado na Tabela 1. A emulsão é muito viscosa e espessa, portanto, durante o procedimento de preparação e injeção, pode haver alguma perda, especialmente ao preparar a solução para alguns camundongos. Sugerimos calcular o volume final de emulsão necessário superestimando o número de camundongos a serem imunizados em pelo menos 1,5-2 vezes.
2. Coloque o copo no gelo e utilize a seringa de vidro com uma agulha de 18 G para começar a emulsionar a solução.
   NOTA: A emulsão também pode ser preparada usando outras estratégias, por exemplo, conectando as duas seringas de vidro air-free com uma torneira de três vias e misturando a solução empurrando os êmbolos para frente e para trás^21,22.
3. Emulsionar a solução durante, pelo menos, 15 min; Geralmente, 30 min de emulsificação são suficientes. Para verificar a qualidade da emulsão, adicione uma gota de emulsão em um recipiente transparente cheio de água: se a gota mantiver sua estrutura e permanecer intacta, a emulsão está pronta.
4. Coloque a emulsão diretamente dentro das seringas de 1 mL que serão utilizadas para a imunização e guarde-as a +4 °C até o uso para preservar a espessura da emulsão e evitar alterações ou contaminações.

2. Seleção e imunização dos animais

1. Seleção de animais
   1. Selecione camundongos adultos C57BL/6J de ambos os sexos com 8-10 semanas de idade com um peso corporal ideal de ~20 g. Certifique-se de selecionar camundongos pareados por idade e sexo para diferentes grupos experimentais, pois a suscetibilidade à doença pode variar com a idade e o sexo.
      NOTA: Os ratos devem ter um peso corporal comparável no dia da imunização, porque o presente procedimento é otimizado para uma determinada faixa de peso corporal (17-25 g).
   2. Abrigar animais do mesmo sexo em grupos (n = 4-5/gaiola) para evitar o isolamento social em condições padrão em gaiolas de camundongos de polipropileno de 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, sob ciclo claro/escuro de 12:12 (luzes acesas às 08:00 AM). Fornecer comida e água ad libitum.
      NOTA: Eventualmente, para limitar ainda mais a variabilidade potencial do curso da doença nos animais imunizados, também sugerimos a formação de grupos experimentais suficientemente numerosos. Há também estudos ^8,23 que descrevem o momento da imunização como uma condição que determina a variação no desfecho EAE. Assim, sugere-se realizar a imunização aproximadamente na mesma hora em todos os animais, preferencialmente durante as horas claras do ciclo claro/escuro diário²³. Para limitar o estresse, é preferível manipular os animais antes do dia da imunização e marcá-los para identificá-los facilmente para avaliação diária, por exemplo, corte de orelha ou etiqueta.
2. O procedimento de imunização
   NOTA: Certifique-se de que o procedimento seja realizado por um investigador experiente para minimizar o estresse dos animais e otimizar a imunização. Antes de iniciar a imunização, selecione o método anestésico de acordo com as diretrizes institucionais do comitê de ética e cuidados com os animais. Nosso laboratório utiliza anestesia breve com isoflurano.
   1. Anestesiar o camundongo: isoflurano a 4% para indução anestésica e isoflurano a 1,5-2% para manutenção da anestesia. Aguarde a eficácia da anestesia e use uma pinça dos dedos dos pés de trás e da frente para avaliar o nível de anestesia. Para evitar o ressecamento dos olhos enquanto o rato está sob anestesia, use uma pomada ocular aprovada por veterinário.
   2. Injeção intravenosa de TP na veia caudal lateral: tampar a cauda do camundongo suavemente com uma solução de etanol, que atua como vasodilatador, para exibir as veias. Focalizar uma das duas veias laterais da cauda e, usando uma seringa de 0,5 mL equipada com uma agulha de 30 G, injetar 500 ng de TP (ou seja, 100 μL de TP diluídos em solução fisiológica na concentração de 5 μg/mL).
   3. Injeção subcutânea de emulsão MOG_35-55 : utilizando a seringa de 1 mL com agulha de 26 G, realizar três injeções subcutâneas da emulsão previamente preparada: duas sob a parte rostral dos flancos e uma na base da cauda. O volume de emulsão injetado em cada local é de 100 μL, para um volume total de 300 μL de emulsão injetado em cada camundongo.
      OBS: O dia da imunização é registrado como dia 0 pós-imunização (dpi); 48 h depois (ou seja, a 2 dpi), é necessária a realização de nova injeção intravenosa de TP igual à realizada anteriormente. É possível realizar a injeção sem anestesia, usando um filtro de mouse. O procedimento aqui descrito visa induzir e manter a anestesia dos camundongos durante o procedimento de imunização para evitar possíveis desconfortos e movimentos dos animais ou riscos tanto para camundongos quanto para os pesquisadores. Assim, não há procedimentos cirúrgicos. No entanto, para otimizar os processos experimentais, é importante manter condições estéreis adequadas durante essas etapas e monitorar a condição do camundongo após esses procedimentos.
   4. Para verificar se o rato se recuperou das injeções, coloque-o em uma gaiola limpa após os procedimentos e aguarde até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Depois que o rato estiver totalmente recuperado, devolva-o à gaiola de casa com outros animais.

3. Acompanhamento do EAE

1. Peso corporal e ingestão alimentar
   1. Monitorar diariamente o peso corporal (PC) dos animais, utilizando balança eletrônica de precisão, pois a diminuição do PN é um indicador da progressão da doença.
      OBS: Essa diminuição não deve ultrapassar um determinado percentual, de acordo com as diretrizes institucionais e do comitê de ética para cuidados com os animais. Normalmente, se um animal perde mais de 20% do peso corporal inicial (ou seja, o peso registrado em 0 dpi), ele deve ser sacrificado como a aplicação do desfecho humano. Os métodos de eutanásia envolvem anestesia profunda irreversível para inalação (por exemplo, isoflurano a 5%) seguida de decapitação.
   2. Monitorar a ingestão alimentar (IA) - o alimento ingerido por um animal em um dia (g∙^dia-1∙^animal-1), pesando a quantidade de alimento no recipiente específico pelo menos uma vez por semana e dividindo a quantidade de alimento ingerido para os dias passados entre duas medidas sequenciais e o número de animais presentes na gaiola.
      OBS: Esta medida permite estimar a média de consumo alimentar. Devido ao aparecimento e acúmulo de sinais clínicos da doença, que envolvem a paralisia dos membros, sugerimos colocar algum alimento regado no chão da gaiola quando os animais não forem capazes de ficar firmes em seus membros posteriores e alcançar o recipiente de comida ou a garrafa de água. Para avaliar a ingestão alimentar ao longo do período de acompanhamento da forma mais precisa possível, também medimos o peso seco desse alimento antes de molhá-lo para os camundongos.
2. Avaliação da ciclicidade estral durante EAE
   1. Verificar o ciclo estral por pelo menos dois ciclos, avaliando os esfregaços citológicos vaginais conforme descrito por McLean et ^al.24. Classificar a fase do ciclo estral com base na presença de três tipos celulares primários - células epiteliais nucleadas, células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos - nas amostras de esfregaço vaginal, da seguinte forma:
      1. Classificar como proestro com base na presença quase exclusiva de aglomerados de células epiteliais nucleadas arredondadas e bem formadas.
      2. Classificar como estro com base na presença predominante de aglomerados densamente compactados de células epiteliais escamosas cornificadas.
      3. Classificar como metestro com base na presença predominante de pequenos leucócitos escuros e na menor presença de células epiteliais escamosas cornificadas.
      4. Classificar como diestro com base na presença altamente predominante de pequenos leucócitos corados escuramente e raras células epiteliais escamosas cornificadas, juntamente com o possível aparecimento de células epiteliais nucleadas.
         OBS: Ao avaliar a doença em ambos os sexos, é importante verificar a variabilidade no sexo feminino devido ao ciclo estral. Sugere-se focar na avaliação do ciclo estral, especialmente entre a primeira e a segunda semana pós-imunização (ou seja, durante a fase aguda das EAE). Já foi demonstrado anteriormente que o procedimento de imunização provoca as alterações mais pronunciadas do ciclo estral dentro dessa fase²⁵. Além disso, é importante considerar que a realização do esfregaço quando o animal atinge um escore clínico alto (principalmente >3) é difícil devido à paresia posterior e à falta de tônus nos membros pélvicos.
3. Escore clínico
   1. Peça a um investigador cego que avalie diariamente o escore clínico dos animais. Atribua a cada animal uma pontuação de 0 a 5 (ver Tabela 2) para avaliar o curso da doença²⁶ , conforme descrito por Racke⁷.
      OBS: Semelhante à diminuição do peso corporal, um desfecho humanizado também é necessário para o aumento dos escores clínicos, de acordo com as diretrizes do comitê de ética institucional para cuidados com os animais. Geralmente, se um animal não é mais capaz de se alimentar de forma autônoma (isso geralmente ocorre quando um animal atinge pelo menos a pontuação de 4, de acordo com a escala que usamos), ele deve ser sacrificado como a aplicação do endpoint humano.
4. Avaliação do desempenho motor pelo teste rotarod
   NOTA: A avaliação da progressão do EAE é geralmente realizada atribuindo-se o escore clínico diariamente, o que é feito por um investigador cego totalmente treinado. No entanto, poderia ser útil ladeá-la com uma avaliação mais quantitativa e objetiva da progressão da doença. Em estudo prévio²⁶, o teste rotarod foi utilizado para medir o desempenho motor dos animais imunizados. Como descrito por van den Berg et ^al.27, para uma avaliação clínica mais quantitativa e precisa do curso da doença, a avaliação do desempenho motor pelo teste rotarod pode subsidiar a avaliação do escore clínico. Para uma descrição detalhada, ver van den Berg et ^al.27.
   1. Deixe os ratos serem submetidos a sessões de rotarod diariamente, a partir de 1 dpi até o sacrifício (ou seja, 28 dpi). Cada sessão consiste em uma única sessão de 300 s, durante a qual a velocidade da haste deve ser aumentada linearmente de 4 a 40 rpm.
   2. Registre a pontuação do animal. Quando o mouse não é capaz de manter seu equilíbrio e cai do dispositivo, ele cai no chão e aciona um sensor, e o(s) tempo(s) é registrado(s). Assim, o desempenho é pontuado como latência para queda(s).

Grau	Sinal clínico		Descrição
0	Saudável		Nenhum sinal clínico observado. O animal apresenta um tom normal e movimentação da cauda. Anda sem tropeçar.
0.5	Portão prejudicado		O animal tropeça enquanto caminha em uma churrasqueira.
1	Cauda manca		Quando o animal é apanhado pela base da cauda, a cauda cai (cauda flácida).
1.5	Cauda manca e portão prejudicado		O animal mostra uma cauda flácida, e tropeça enquanto caminha em uma churrasqueira.
2	Ataxia		O animal apresenta dificuldades em levantar-se depois de ter sido virado de costas.
2.5	Ataxia e paresia de membro posterior		O animal não consegue se levantar depois de ter sido virado de costas, e perde o tom de um de seus membros posteriores.
3	Paralisia dos membros posteriores		O animal perde o tônus de ambos os membros posteriores.
3.5	Paralisia de membros pélvicos e/ou paresia de membro torácico		O animal perde o tônus de ambos os membros pélvicos e parcialmente dos membros torácicos. Na verdade, mostra uma perda de força na preensão dos membros anteriores.
4	Tetraparesia		O animal perde completamente o tônus de seus membros.
4.5	Tetraparesia e diminuição da temperatura corporal		O animal perde completamente o tônus de seus membros, e apresenta uma diminuição da temperatura corporal (está frio).
5	Morrer ou morrer		O animal está morrendo (não responde a nenhum estímulo) ou morto.

Tabela 2: Sistema de escore clínico utilizado para avaliar a progressão do EAE.

4. Avaliação dos sinais histopatológicos induzidos por EAE ao nível da medula espinhal

OBS: Relatamos brevemente o procedimento de sacrifício dos animais e coleta medular para análise histopatológica; Para uma descrição detalhada, ver estas referências 10,26,28,29.

1. Fixação e amostragem de tecidos
   NOTA: Para obter uma descrição detalhada, consulte estas referências^10,26.
   1. Sacrificar os animais a 28 dpi durante a fase crônica da doença.
      1. Anestesiar os camundongos por anestesia profunda irreversível (injeção intraperitoneal de Zolazepam e Tiletamina 80 mg/kg / Xilazina 10 mg/kg).
      2. Perfundir os camundongos por via transcárdica com solução salina seguida de solução de paraformaldeído (PFA) a 4%.
         OBS: Preste atenção ao usar o PFA: por ser tóxico, evite inalação, ingestão e contato com a pele e os olhos utilizando equipamentos de proteção individual adequados. Pesar o pó, preparar a solução e realizar a perfusão sob o capô.
   2. Remover a medula espinhal da coluna vertebral³⁰.
   3. Armazenar a medula espinhal em uma solução de PFA a 4% por 24 horas.
   4. Realizar várias lavagens em tampão fosfato salino (PBS) 0,01 M.
   5. Embutir a medula espinhal em blocos de parafina³⁰.
2. Procedimentos histológicos
   NOTA: Para uma descrição detalhada, ver Montarolo et ^al.10.
   1. Use um micrótomo para cortar cortes transversais da medula espinhal de 10 μm de espessura e coletá-los em lâminas revestidas de gelatina. Orientar o plano de secção para corresponder aos desenhos correspondentes às secções transversais do atlas da medula espinhal do rato³¹.
   2. Realizar a desparafinização dos cortes³².
   3. Coloração do corte com Hematoxilina e Eosina³².
   4. Desidratar as secções³².
   5. Cubra as seções com um meio de montagem e deixe-as secar à temperatura ambiente sob uma coifa química.
      NOTA: A coloração pela hematoxilina-eosina permite detectar a presença de infiltrados inflamatórios perivasculares (PvIIs)²⁶, o que é avaliado como sinal da^doença28.
3. Análise quantitativa dos cortes medulares
   1. Adquirir imagens dos cortes corados com microscópio óptico conectado a uma câmera digital com objetiva 20x²⁹.
   2. Analise a imagem adquirida para obter o número de PvIIs, expresso como o número de infiltrados por mm².
      NOTA: Para a análise das imagens adquiridas, é útil tirar proveito de um software de análise de imagens. Os achados neuropatológicos apresentados neste trabalho são quantificados em 10 cortes transversais completos da medula espinhal por camundongo (n = 8/grupo) representativos de todos os níveis medulares.

Resultados

Acompanhamento das EAE após a imunização
Isso foi avaliado conforme descrito a seguir.

Peso corporal e ingestão alimentar
A análise de variância (ANOVA) two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) mostra uma diminuição no PN dos animais EAE de ambos os sexos, especialmente na segunda semana pós-indução (F_(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). No entanto, o dimorfismo sexual no...

Discussão

O protocolo de EAE induzido por MOG_35-55 que descrevemos levou ao desenvolvimento de uma forma crônica de EM em camundongos C57BL/6J7,8,13. Nesses resultados representativos, relatamos que os animais de ambos os sexos submetidos ao procedimento de imunização desenvolveram uma forma crônica da doença (ou seja, não se recuperam totalmente após o início da doença, acumulam déficits e mantêm um EC de pelo menos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic