İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

Özet

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. Cinsiyetlerde farklı prevalans, erkeklerden daha fazla kadını etkileme ve erkeklerde kadınlardan daha agresif formlar gösteren farklı sonuçlar ile karakterizedir. Ayrıca MS, klinik yönleri, radyolojik ve patolojik özellikleri açısından oldukça heterojendir. Bu nedenle, patolojinin mümkün olduğunca çok yönünün araştırılmasına izin veren deneysel hayvan modellerinden yararlanmak gerekir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), farelerde en çok kullanılan MS modellerinden birini temsil eder ve bağışıklık sisteminin aktivasyonundan CNS hasarına kadar farklı hastalık özelliklerini modeller. Burada, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid 35-55 (MOG_35-55) bağışıklaması kullanılarak hem erkek hem de dişi C57BL / 6J farelerinde EAE'nin indüksiyonu için bir protokol tanımlanmıştır, bu da hastalığın kronik bir formunun gelişmesine yol açar. Ayrıca, bu farelerin bağışıklamadan sonraki 28 gün boyunca günlük klinik skor ve motor performanslarının değerlendirilmesini de rapor ediyoruz (28 dpi). Son olarak, hastalığa bağlı hasarın birincil bölgesi olarak omuriliğe odaklanarak CNS düzeyinde bazı temel histolojik analizleri gösteriyoruz.

Giriş

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. İnflamatuar hücrelerin perivasküler infiltrasyonu, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis¹ varlığını gösterir. Etiyolojisi tam olarak bilinmemektedir ve klinik yönleri, radyografik ve patolojik özellikleri hastalıkta dikkate değer heterojenliği düşündürmektedir².

Etiyolojisinin bilinmemesi ve karmaşıklığı nedeniyle, şu anda hiçbir hayvan modeli, insan MS'de görüntülenen tüm klinik ve radyolojik özellikleri özetlememektedir ^3,4....

Protokol

Bu çalışmada hayvanların bakımı ve idaresi, 22^Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Konseyi Direktifine (2010/63/UE) göre gerçekleştirilmiştir; Bu çalışmada bildirilen tüm prosedürler İtalya Sağlık Bakanlığı (407/2018-PR) ve Torino Üniversitesi Etik Komitesi (Proje n° 360384) tarafından onaylanmıştır. Deneysel tasarıma, ilk olarak Kilkenny ve ark. 2010'da²⁰. Başlamadan önce gerekli malzemelerin mevcut olduğundan emin olun (bkz. MOG_35-55 emülsiyonunun hazırlanmasında kullanılan tüm cam eşyaları ve kapları bir otoklavda sterilize edin. Deneysel prosedürlerin bir özeti Şekil 1'de gös....

Tartışmalar

Tanımladığımız MOG_35-55 kaynaklı EAE protokolü, C57BL / 6J farelerinde kronik bir MS formunun gelişmesine yol açtı ^7,8,13. Bu temsili sonuçlarda, bağışıklama prosedürüne tabi tutulan her iki cinsiyetten hayvanların hastalığın kronik bir formunu geliştirdiğini bildirdik (yani, hastalık başlangıcından sonra tam olarak iyileşmezler, açıklar biriktirirler ve kronik fazda en az 1.5'lik bir CS'.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic