İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

Özet

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. Cinsiyetlerde farklı prevalans, erkeklerden daha fazla kadını etkileme ve erkeklerde kadınlardan daha agresif formlar gösteren farklı sonuçlar ile karakterizedir. Ayrıca MS, klinik yönleri, radyolojik ve patolojik özellikleri açısından oldukça heterojendir. Bu nedenle, patolojinin mümkün olduğunca çok yönünün araştırılmasına izin veren deneysel hayvan modellerinden yararlanmak gerekir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), farelerde en çok kullanılan MS modellerinden birini temsil eder ve bağışıklık sisteminin aktivasyonundan CNS hasarına kadar farklı hastalık özelliklerini modeller. Burada, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid 35-55 (MOG_35-55) bağışıklaması kullanılarak hem erkek hem de dişi C57BL / 6J farelerinde EAE'nin indüksiyonu için bir protokol tanımlanmıştır, bu da hastalığın kronik bir formunun gelişmesine yol açar. Ayrıca, bu farelerin bağışıklamadan sonraki 28 gün boyunca günlük klinik skor ve motor performanslarının değerlendirilmesini de rapor ediyoruz (28 dpi). Son olarak, hastalığa bağlı hasarın birincil bölgesi olarak omuriliğe odaklanarak CNS düzeyinde bazı temel histolojik analizleri gösteriyoruz.

Giriş

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. İnflamatuar hücrelerin perivasküler infiltrasyonu, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis¹ varlığını gösterir. Etiyolojisi tam olarak bilinmemektedir ve klinik yönleri, radyografik ve patolojik özellikleri hastalıkta dikkate değer heterojenliği düşündürmektedir².

Etiyolojisinin bilinmemesi ve karmaşıklığı nedeniyle, şu anda hiçbir hayvan modeli, insan MS'de görüntülenen tüm klinik ve radyolojik özellikleri özetlememektedir ^3,4. Bununla birlikte, MS ^3,4'ün farklı yönlerini incelemek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bu modellerde, hastalığın başlaması tipik olarak son derece yapaydır ve klinik belirtilerin başlama süresi insanlar ve fareler arasında farklıdır. Örneğin, insanlarda, hastalığın altında yatan patofizyolojik süreçler, klinik belirtilerin başlamasından yıllar önce tespit edilmez. Tersine, deneyciler MS^{indüksiyonundan sonraki} haftalar hatta günler içinde hayvan modellerinde semptomları tespit edebilirler 4.

Üç temel hayvan modeli, MS'in karakteristiği olan demiyelinizasyon özelliklerini üretir: virüs kaynaklı olanlar (örneğin, Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsü), toksik ajanlar tarafından indüklenenler (örneğin, cuprizone, lizolesitin) ve deneysel otoimmün ensefalomiyelitin (EAE) farklı ^{varyantları5}. Her model, hastalığın bazı spesifik yönlerini incelemeye yardımcı olur, ancak hiçbiri MS^6'nın tüm özelliklerini kopyalamaz. Bu nedenle, belirli deneysel ihtiyaçları ve ele alınacak bilimsel soruları göz önünde bulundurarak doğru modeli seçmek çok önemlidir.

Miyelin türevi antijenlere karşı bağışıklama prosedürleri sayesinde, EAE, duyarlı farelerde CNS bileşenlerine otoimmün bir yanıtı tetikleyerek indüklenir. Çok çeşitli immünopatolojik ve nöropatolojik mekanizmalar arasındaki etkileşim, aşılanmış farelerde MS'in temel patolojik özelliklerinin (yani inflamasyon, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis) gelişmesine neden olur ^7,8. Fareler, aşılamadan sonraki ikinci hafta civarında klinik semptomlar göstermeye başlar ve genellikle kuyruktan uzuv ve ön ayağa artan felç gösterir. Klinik skor (yani, hastalıkla ilişkili eksikliklerin birikiminin ölçülmesi) genellikle 5 puanlık bir ölçek⁷ kullanılarak değerlendirilir.

Protein veya peptit ile aktif bağışıklama veya ensefalojenik T hücrelerinin pasif transferi, farklı genetik geçmişe sahip farelerde (örneğin, SJL / J, C57BL / 6 ve obez olmayan diyabetik (NOD) fareler) EAE'yi indüklemek için kullanılabilir. Miyelin proteolipid proteini (PLP), miyelin bazik proteini (MBP) ve miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG), immünojenlerin genellikle üretildiği kendi kendine CNS proteinlerinin örnekleridir. Özellikle, PLP'nin immünodominant epitopu (PLP_139-151) ile aşılanan SJL/J fareleri, nükseden-düzelen (RR) bir hastalık seyri geliştirirken, immünodominant MOG_35-55 peptidi ile aşılanan C57BL/6J fareleri, kronik bir yapıya sahip EAE gösterir¹. MS progresyonu hakkında çok az bilgi verilmesi, B hücrelerinin hastalıktaki rolü, içten dışa mekanizmalar veya remiyelinizasyonun incelenmesindeki zorluklar gibi bazı sınırlamalara rağmen, EAE modelleri otoimmün ve nöroinflamatuar süreçlerin anlaşılmasına büyük katkı sağlamış, MS alanındaki bilgiyi arttırmış ve böylece bu hastalık için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine olanak sağlamıştır^{4, 6}.

Bu çalışmada, aktif EAE'nin belirli bir formuna, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG_35-55) ile indüklenen form ^{9,10,11,12'ye} odaklandık. MOG_35-55 ile indüklenen EAE, kronik bir MS formunu modeller. Bağışıklamadan sonra, fareler bağışıklamadan sonraki ilk hafta içinde asemptomatik bir aşamaya girer, daha sonra hastalık tipik olarak aşılamadan sonraki ikinci hafta içinde ortaya çıkarken, bağışıklamadan sonraki üçüncü ve dördüncü haftalar arasında hastalık kronikleşir ve biriken açıklardan tam iyileşme olasılığı yoktur ^7,8,13. İlginç bir şekilde, literatürde bulunan çalışmaların çoğunda insidans, hastalık başlangıcı, seyri veya ilerlemesi açısından erkekler ve kadınlar arasında hiçbir fark gözlenmemiştir¹⁴, daha az çalışma erkeklerde ve kadınlarda hastalığı karşılaştırsa bile.

Buna karşılık, insanlarda, bu parametrelerin güçlü bir şekilde cinsel olarak dimorfik olduğu bilinmektedir². MS erkeklerden daha fazla kadını etkiler; Bununla birlikte, erkekler genellikle hastalığın daha agresif bir formunu geliştirir². Bu kanıt, gonadal hormonların¹⁵ önemli ve karmaşık bir rolünü ortaya koymuştur; Bununla birlikte, seks hormonlarının patolojideki rolü ve etki mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, hayvan modellerinden elde edilen veriler, hem östrojenlerin hem de androjenlerin patolojinin farklı yolları üzerinde cinsiyete özgü bir şekilde olumlu etkiler gösterdiği fikrini desteklemektedir^16,17.

Bazı çalışmalar ayrıca progesteronun nöroprotektif, promiyelinizan ve antienflamatuar etkilerini göstermektedir¹⁸ ve MS hastalarında kanıtlar az olmasına rağmen¹⁸, nöroaktif steroidler (yani, pregnenolon, tetrahidroprogesteron ve dihidroprogesteron gibi sinir sistemi tarafından de novo sentezlenmiş steroidler) de patolojik seyri^{etkileyebilir 19}. Toplu olarak, bu veriler hem periferik hem de CNS içinde üretilen seks hormonlarının hastalık başlangıcında ve ilerlemesinde önemli ve cinsiyete özgü bir role sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada, hem erkek hem de dişi hayvanlardan ayrı verilerin toplanmasını teşvik ediyoruz.

Histopatolojik açıdan bakıldığında, omuriliğin beyaz cevheri, mononükleer inflamatuar infiltrasyon ve demiyelinizasyonun^multifokal, birleşik bölgeleri ile karakterize edilen bu modelde CNS hasarının ana bölgesi olarak hizmet eder 8. Bu nedenle, C57BL/6J farelerinde MOG_35-55 ile indüklenen EAE'nin indüksiyonu için bu protokolü tanımlarken, iki cinsiyetteki hastalık sonucunu dikkate alacağız ve omuriliklerle ilgili bazı histopatolojik bilgiler sağlayacağız.

Protokol

Bu çalışmada hayvanların bakımı ve idaresi, 22^Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Konseyi Direktifine (2010/63/UE) göre gerçekleştirilmiştir; Bu çalışmada bildirilen tüm prosedürler İtalya Sağlık Bakanlığı (407/2018-PR) ve Torino Üniversitesi Etik Komitesi (Proje n° 360384) tarafından onaylanmıştır. Deneysel tasarıma, ilk olarak Kilkenny ve ark. 2010'da²⁰. Başlamadan önce gerekli malzemelerin mevcut olduğundan emin olun (bkz. MOG_35-55 emülsiyonunun hazırlanmasında kullanılan tüm cam eşyaları ve kapları bir otoklavda sterilize edin. Deneysel prosedürlerin bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. MOG_35-55 emülsiyonunun hazırlanması

NOT: Emülsiyonu hazırlamak için MOG_35-55, tamamlanmamış Freud adjuvanı (IFA), Mycobacterium Tuberculosis suşu H37Ra (MT) ve fizyolojik çözelti gereklidir (bkz.

DİKKAT: Isıyla öldürülen MT, doğuştan gelen bağışıklık tepkisini uyarabilir. Solumaktan, yutmaktan ve cilt ve gözlerle temasından kaçının, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve MT'yi kaputun altındaki kapalı bir hassas terazide tartın.

Çözüm	Kompozisyon	Notlar
2 mg/mL MOG35-55 peptit çözeltisi	2 mg / mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilmiş liyofilize MOG35-55 peptidi	Zaten seyreltilmiş çözeltiyi -80 °C'de muhafaza edin.
5 μg/mL PT çözeltisi	Liyofilize PT, 5 μg/mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilir.	Zaten seyreltilmiş çözeltiyi -80 °C'de muhafaza edin.
Emülsiyon	Aşılanacak her fare için gereken toplam emülsiyon hacmi 300 μL'dir ve aşağıdaki gibi bölünür:	Değişiklikleri veya kontaminasyonu önlemek için, emülsiyonu aşılama günü hazırlayın.
	200 μg/fare MOG35-55 , yani 100 μL MOG35-55 2 mg/mL çözelti.
	50 μL fizyolojik çözelti
	150 μL IFA
	4 mg / mL MT, yani 1.2 mg / fare
Fizyolojik çözüm	Sodyum klorür% 0.9 damıtılmış suda seyreltilir.

Tablo 1: Bağışıklama prosedürü için kullanılan çözeltilerin bileşimi.

1. Çözeltiyi bir cam beherde hazırlayın, önce sıvı bileşeni ve son olarak MT'yi ekleyin.
   NOT: Aşılanacak her fare için gereken toplam emülsiyon hacmi, Tablo 1'de gösterildiği gibi bölünerek 300 μL'dir. Emülsiyon çok viskoz ve kalındır, bu nedenle hazırlama ve enjeksiyon prosedürü sırasında, özellikle birkaç fare için çözelti hazırlanırken bir miktar kayıp olabilir. Aşılanacak fare sayısını en az 1.5-2 kat fazla tahmin ederek ihtiyaç duyulan nihai emülsiyon hacmini hesaplamanızı öneririz.
2. Beheri buza yerleştirin ve çözeltiyi emülsifiye etmeye başlamak için cam şırıngayı 18 G'lik bir iğne ile kullanın.
   NOT: Emülsiyon, örneğin iki havasız cam şırıngayı üç bir vana ile bağlayarak ve pistonları ileri geri iterek^{çözeltiyi karıştırarak başka} stratejiler kullanılarak da hazırlanabilir ^21,22.
3. Çözeltiyi en az 15 dakika emülsifiye edin; Genellikle 30 dakikalık emülsifikasyon yeterlidir. Emülsiyonun kalitesini kontrol etmek için, suyla dolu şeffaf bir kaba bir damla emülsiyon ekleyin: damla yapısını korur ve sağlam kalırsa, emülsiyon hazırdır.
4. Emülsiyonu doğrudan bağışıklama için kullanılacak 1 mL'lik şırıngaların içine yerleştirin ve emülsiyonun kalınlığını korumak ve değişiklik veya kontaminasyonları önlemek için bunları kullanıma kadar +4 °C'de saklayın.

2. Hayvan seçimi ve bağışıklama

1. Hayvan seçimi
   1. Optimal vücut ağırlığı ~20 g olan 8-10 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin C57BL/6J fareleri seçin. Farklı deney grupları için yaş ve cinsiyete uygun fareler seçtiğinizden emin olun, çünkü hastalığa yatkınlık yaş ve cinsiyete göre değişebilir.
      NOT: Fareler, bağışıklama gününde karşılaştırılabilir vücut ağırlığına sahip olmalıdır, çünkü mevcut prosedür belirli bir vücut ağırlığı aralığı (17-25 g) için optimize edilmiştir.
   2. Standart koşullarda sosyal izolasyonu önlemek için eşcinsel hayvanları gruplar halinde (n = 4-5/kafes) 45 cm x 25 cm x 15 cm polipropilen fare kafeslerinde 22 ± 2 °C'de, 12:12 aydınlık/karanlık döngüsünün altında (ışıklar 08:00'de yanar) barındırın. Yiyecek ve su ad libitum sağlayın.
      NOT: Sonuç olarak, aşılanmış hayvanlarda hastalık seyrinin potansiyel değişkenliğini daha da sınırlamak için, yeterince sayıda deney grubu oluşturmayı da öneriyoruz. Bağışıklamanın zamanlamasını EAE sonucundaki varyasyonu belirleyen bir durum olarak tanımlayan çalışmalar^{da 8,23} vardır. Bu nedenle, bağışıklamanın tüm hayvanlarda yaklaşık olarak aynı saatte, tercihen günlük aydınlık/karanlık döngüsünün^{aydınlık saatlerinde yapılmasını öneriyoruz 23}. Stresi sınırlamak için, hayvanları aşılama gününden önce manipüle etmek ve örneğin kulak kırpma veya etiket gibi günlük değerlendirme için kolayca tanımlamak için işaretlemek tercih edilir.
2. Bağışıklama prosedürü
   NOT: Hayvanlar için stresi en aza indirmek ve bağışıklamayı optimize etmek için prosedürün deneyimli bir araştırmacı tarafından yapıldığından emin olun. Bağışıklamaya başlamadan önce kurum hayvan bakım ve etik kurul yönergelerine uygun anestezi yöntemini seçiniz. Laboratuvarımızda izofluran ile kısa süreli anestezi kullanılmaktadır.
   1. Fareyi uyuşturun: anestezi indüksiyonu için% 4 izofluran ve anestezi bakımı için% 1.5-2 izofluran. Anestezinin etkili olmasını bekleyin ve anestezi seviyesini değerlendirmek için arka ve ön ayak parmağı tutamını kullanın. Fare anestezi altındayken gözlerin kuruluğunu önlemek için veteriner onaylı bir göz merhemi kullanın.
   2. Lateral kaudal damarda PT intravenöz enjeksiyonu: damarları görüntülemek için farenin kuyruğunu vazodilatör görevi gören bir etanol çözeltisiyle hafifçe takın. Kuyruğun iki yan damarından birine odaklanın ve 30 G'lik bir iğne ile donatılmış 0,5 mL'lik bir şırınga kullanarak 500 ng PT enjekte edin (yani, 5 μg/mL konsantrasyonda fizyolojik çözelti içinde seyreltilmiş 100 μL PT).
   3. MOG_35-55 emülsiyonunun deri altı enjeksiyonu: 26 G iğneli 1 mL şırıngayı kullanarak, önceden hazırlanmış emülsiyonun üç deri altı enjeksiyonunu gerçekleştirin: ikisi yanların rostral kısmının altında ve biri kuyruğun tabanında. Her bölgeye enjekte edilen emülsiyon hacmi 100 μL'dir ve her fareye enjekte edilen toplam 300 μL emülsiyon hacmi vardır.
      NOT: Bağışıklama günü, aşılamadan sonraki 0. gün (dpi) olarak kaydedilir; 48 saat sonra (ör., 2 dpi'de), daha önce yapılana eşit başka bir intravenöz PT enjeksiyonu yapmak gerekir. Enjeksiyonu anestezi olmadan, bir fare tutucu kullanarak yapmak mümkündür. Burada açıklanan prosedür, hayvanların olası rahatsızlıklarını ve hareketlerini veya hem fareler hem de araştırmacılar için riskleri önlemek için bağışıklama prosedürü sırasında farelerin uyuşturulmasını ve sürdürülmesini amaçlamaktadır. Bu nedenle herhangi bir cerrahi işlem söz konusu değildir. Bununla birlikte, deneysel süreçleri optimize etmek için, bu adımlar sırasında uygun steril koşulların sağlanması ve bu işlemlerden sonra farenin durumunun izlenmesi önemlidir.
   4. Farenin enjeksiyonlardan kurtulduğunu doğrulamak için, işlemlerden sonra temiz bir kafese koyun ve sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bekleyin. Fare tamamen iyileştikten sonra, diğer hayvanlarla birlikte ev kafesine geri koyun.

3. EAE takibi

1. Vücut ağırlığı ve gıda alımı
   1. Elektronik bir hassas terazi kullanarak hayvanların vücut ağırlığını (BW) günlük olarak izleyin, çünkü BW'deki azalma hastalığın ilerlemesinin bir göstergesidir.
      NOT: Bu azalma, kurumsal ve etik kurulun hayvan bakımı yönergelerine göre belirli bir yüzdeyi geçmemelidir. Genellikle, bir hayvan başlangıçtaki vücut ağırlığının %20'sinden fazlasını kaybederse (yani, 0 dpi'de kaydedilen ağırlık), insancıl son noktanın uygulaması olarak feda edilmelidir. Ötenazi yöntemleri, inhalasyon için derin geri dönüşümsüz anestezi (örneğin,% 5 izofluran) ve ardından dekapitasyon içerir.
   2. Yiyecek alımını (FI) izleyin - bir hayvan tarafından bir günde yenen yiyecek (g∙^day-1∙^hayvan-1), belirli bir kaptaki yiyecek miktarını haftada en az bir kez tartın ve iki ardışık ölçüm arasında geçen günler için yenen yiyecek miktarını ve kafeste bulunan hayvan sayısını bölün.
      NOT: Bu ölçüm, ortalama gıda alımının tahmin edilmesini sağlar. Uzuvların felç olmasını içeren klinik hastalık belirtilerinin ortaya çıkması ve birikmesi nedeniyle, hayvanlar arka bacakları üzerinde sıkıca duramadıklarında ve yiyecek kabına veya su şişesine ulaşamadıklarında kafesin zeminine biraz sulanmış yiyecek koymanızı öneririz. Takip süresi boyunca gıda alımını mümkün olduğunca hassas bir şekilde değerlendirmek için, fareler için ıslatmadan önce bu yiyeceğin kuru ağırlığını da ölçtük.
2. EAE sırasında kızgınlık döngüsünün değerlendirilmesi
   1. McLean ve ^ark.24 tarafından tarif edildiği gibi vajinal sitoloji yaymalarını değerlendirerek östrus döngüsünü en az iki döngü için kontrol edin. Vajinal smear örneklerinde üç birincil hücre tipinin (çekirdekli epitel hücreleri, kornifiye skuamöz epitel hücreleri ve lökositler) varlığına göre östrus döngüsünün fazını aşağıdaki gibi sınıflandırın:
      1. Yuvarlak, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücrelerinin kümelerinin neredeyse münhasır varlığına dayanarak proöstrus olarak sınıflandırın.
      2. Kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin yoğun şekilde paketlenmiş kümelerinin baskın varlığına dayanarak kızgınlık olarak sınıflandırın.
      3. Küçük, koyu boyanmış lökositlerin baskın varlığına ve kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin küçük varlığına dayanarak metestrus olarak sınıflandırın.
      4. Küçük, koyu boyanmış lökositlerin ve nadir kornifiye skuamöz epitel hücrelerinin varlığına ve çekirdekli epitel hücrelerinin olası görünümüne dayanarak diestrus olarak sınıflandırın.
         NOT: Her iki cinsiyette de hastalığı değerlendirirken, kadınlarda kızgınlık döngüsüne bağlı değişkenliği kontrol etmek önemlidir. Özellikle aşılamadan sonraki birinci ve ikinci hafta arasında (yani EAE'nin akut fazı sırasında) östrus döngüsünün değerlendirilmesine odaklanmanızı öneririz. Bağışıklama prosedürünün bu faz²⁵ içinde kızgınlık döngüsünde en belirgin değişikliklere neden olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, hayvan yüksek bir klinik skora (özellikle >3) ulaştığında smear yapılmasının, posterior parezi ve arka ayaklardaki ton eksikliği nedeniyle zor olduğunu düşünmek önemlidir.
3. Klinik skor
   1. Kör bir araştırmacının hayvanların klinik puanını günlük olarak değerlendirmesini sağlayın. Racke 7 tarafından tarif edildiği gibi hastalık seyri^26'yı değerlendirmek için her hayvana 0'dan 5'e kadar derecelendirilmiş bir puan atayın (bakınız Tablo 2).
      NOT: Vücut ağırlığındaki azalmaya benzer şekilde, kurumsal ve etik komitenin hayvan bakımı yönergelerine göre, klinik puanlardaki artış için insancıl bir son nokta da gereklidir. Genel olarak, bir hayvan artık kendini özerk olarak besleyemiyorsa (bu genellikle kullandığımız ölçeğe göre bir hayvan en az 4 puana ulaştığında ortaya çıkar), insancıl son noktanın uygulaması olarak feda edilmelidir.
4. Rotarod testi ile motor performans değerlendirmesi
   NOT: EAE ilerlemesinin değerlendirilmesi genellikle tam eğitimli kör bir araştırmacı tarafından yapılan klinik puanın günlük olarak atanmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, hastalığın ilerlemesinin daha nicel ve objektif bir değerlendirmesi ile onu kuşatmak faydalı olabilir. Daha önceki bir çalışmada²⁶, aşılanmış hayvanların motor performansını ölçmek için rotarod testi kullanılmıştır. Van den Berg ve ^ark.27 tarafından tanımlandığı gibi, hastalık seyrinin daha nicel ve kesin bir klinik değerlendirmesine sahip olmak için, motor performansın rotarod testi ile değerlendirilmesi klinik puan değerlendirmesini destekleyebilir. Ayrıntılı bir açıklama için van den Berg ve ^ark.27'ye bakınız.
   1. Farelerin her gün 1 dpi'den fedakarlığa kadar (yani 28 dpi) rotarod seanslarına girmesine izin verin. Her seans, çubuk hızının doğrusal olarak 4 ila 40 rpm'ye çıkarılması gereken tek bir 300 s seansından oluşur.
   2. Hayvanın puanını kaydedin. Fare dengesini koruyamadığında ve cihazdan düştüğünde yere düşer ve bir sensörü tetikler ve zaman(lar) kaydedilir. Böylece performans, düşme gecikmesi (s) olarak puanlanır.

Derece	Klinik belirti		Tarif
0	Sağlıklı		Gözlenen klinik belirti yok. Hayvan normal bir ton ve kuyruğun hareketini gösterir. Takılmadan yürür.
0.5	Engelli kapı		Hayvan ızgarada yürürken tökezler.
1	Gevşek kuyruk		Hayvan kuyruğun temeli tarafından alındığında, kuyruk sarkar (gevşek kuyruk).
1.5	Gevşek kuyruk ve bozulmuş kapı		Hayvan gevşek bir kuyruk gösterir ve ızgarada yürürken tökezler.
2	Ataksi		Hayvan, sırt üstü çevrildikten sonra ayağa kalkmakta güçlük çeker.
2.5	Ataksi ve arka bacak parezi		Hayvan, sırt üstü çevrildikten sonra ayağa kalkamaz ve arka ayaklarından birinin tonunu kaybeder.
3	Arka ayakların felci		Hayvan her iki arka ayağın tonunu kaybeder.
3.5	Arka ayakların felci ve / veya ön ayakların parezi		Hayvan hem arka ayakların hem de kısmen ön ayakların tonunu kaybeder. Aslında, ön ayakların kavrayışında bir güç kaybı gösterir.
4	Tetra parezi		Hayvan, uzuvlarının tonunu tamamen kaybeder.
4.5	Tetra parezi ve vücut ısısında azalma		Hayvan uzuvlarının tonunu tamamen kaybeder ve vücut ısısında bir düşüş gösterir (soğuktur).
5	Ölmek ya da ölmek		Hayvan ölüyor (herhangi bir uyarana cevap vermiyor) veya ölüyor.

Tablo 2: EAE progresyonunu değerlendirmek için kullanılan klinik skorlama sistemi.

4. Spinal kord düzeyinde EAE'nin neden olduğu histopatolojik bulguların değerlendirilmesi

NOT: Burada, histopatolojik analiz yapmak için hayvanları kurban etme ve omurilikleri toplama prosedürünü kısaca bildiriyoruz; Ayrıntılı bir açıklama için bu referanslara^bakın 10,26,28,29.

1. Fiksasyon ve doku örneklemesi
   NOT: Ayrıntılı bir açıklama için bu referanslara^{bakın 10,26}.
   1. Hastalığın kronik fazında hayvanları 28 dpi'de kurban edin.
      1. Fareleri derin geri dönüşümsüz anestezi ile uyuşturun (intraperitoneal Zolazepam ve Tiletamin enjeksiyonu 80 mg / kg / Ksilazin 10 mg / kg).
      2. Fareleri bir tuzlu su çözeltisi ve ardından% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile transkardiyal olarak perfüze edin.
         NOT: PFA kullanırken dikkat edin: toksik olduğundan, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak solumaktan, yutmaktan ve cilt ve gözlerle temasından kaçının. Tozu tartın, çözeltiyi hazırlayın ve perfüzyonu kaputun altında gerçekleştirin.
   2. Omurilikleri omurgadan^{çıkarın 30}.
   3. Omurilikleri 24 saat boyunca% 4'lük bir PFA çözeltisinde saklayın.
   4. 0.01 M tuzlu fosfat tamponunda (PBS) birkaç yıkama gerçekleştirin.
   5. Omurilikleri parafin bloklarına^{gömün 30}.
2. Histolojik prosedürler
   NOT: Ayrıntılı bir açıklama için Montarolo ve ^ark.10'a bakın.
   1. 10 μm kalınlığındaki enine omurilik bölümlerini kesmek için bir mikrotom kullanın ve bunları jelatin kaplı slaytlarda toplayın. Kesit düzlemini, fare omurilik atlasının enine kesitlerine karşılık gelen çizimlerle eşleşecek şekilde yönlendirin³¹.
   2. Bölümlerin deparafinizasyonunu gerçekleştirin³².
   3. Bölümü Hematoksilen ve Eozin³² ile boyayın.
   4. Bölümleri kurutun³².
   5. Bölümleri bir montaj ortamı ile örtün ve kimyasal bir başlık altında oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
      NOT: Hematoksilen-Eozin boyama, hastalığın bir belirtisi olarak değerlendirilen perivasküler inflamatuar infiltratların (PvII'ler)²⁶⁶ varlığının saptanmasına izin verir²⁸.
3. Omurilik kesitlerinin kantitatif analizi
   1. 20x objektif²⁹ ile bir dijital kameraya bağlı bir optik mikroskop ile lekeli bölümlerin görüntülerini elde edin.
   2. ^mm2 başına sızma sayısı olarak ifade edilen PvII sayısını elde etmek için elde edilen görüntüyü analiz edin.
      NOT: Elde edilen görüntülerin analizi için görüntü analiz yazılımlarından yararlanmakta fayda vardır. Bu çalışmada sunulan nöropatolojik bulgular, tüm omurilik seviyelerini temsil eden fare başına omuriliğin 10 tam kesitinde (n = 8 / grup) ölçülmüştür.

Sonuçlar

Bağışıklama sonrası EAE takibi
Bu, aşağıda açıklandığı gibi değerlendirildi.

Vücut ağırlığı ve gıda alımı
İki yönlü varyans analizi (ANOVA) (bağımsız değişkenler olarak cinsiyet ve zaman), özellikle indüksiyondan sonraki ikinci hafta içinde, her iki cinsiyetten EAE hayvanlarının BW'sinde bir azalma olduğunu göstermektedir (F_(1,57) = 4.952, p < 0.001; Şekil 2A

Tartışmalar

Tanımladığımız MOG_35-55 kaynaklı EAE protokolü, C57BL / 6J farelerinde kronik bir MS formunun gelişmesine yol açtı ^7,8,13. Bu temsili sonuçlarda, bağışıklama prosedürüne tabi tutulan her iki cinsiyetten hayvanların hastalığın kronik bir formunu geliştirdiğini bildirdik (yani, hastalık başlangıcından sonra tam olarak iyileşmezler, açıklar biriktirirler ve kronik fazda en az 1.5'lik bir CS'...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic