两性多发性硬化症建模：MOG35-55 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎是多发性硬化症使用最广泛的小鼠模型之一。在目前的方案中，两性的C57BL / 6J小鼠都用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽免疫，主要导致尾巴和四肢的上行麻痹。在这里，我们讨论EAE诱导和评估的协议。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。它的特点是两性患病率不同，影响的女性多于男性，结果也不同，男性比女性更具侵略性。此外，多发性硬化症在临床方面、影像学和病理学特征方面具有高度异质性。因此，有必要利用实验动物模型，以尽可能多地研究病理学的各个方面。实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是小鼠中最常用的 MS 模型之一，模拟了不同的疾病特征，从免疫系统的激活到中枢神经系统损伤。在这里，我们描述了使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG_35-55）免疫在雄性和雌性C57BL / 6J小鼠中诱导EAE的方案，这导致慢性疾病的发展。我们还报告了免疫接种后28天（28 dpi）对这些小鼠的每日临床评分和运动表现的评估。最后，我们说明了中枢神经系统水平的一些基本组织学分析，重点关注脊髓作为疾病诱导损伤的主要部位。

引言

多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。它显示存在炎症细胞的血管周围浸润、脱髓鞘、轴突缺失和胶质增生¹。其病因尚不清楚，其临床方面、影像学和病理学特征表明该疾病具有显著的异质性²。

由于其病因和复杂性未知，目前尚无动物模型概括人类多发性硬化症中显示的所有临床和放射学特征 ^3,4。然而，采用各种动物模型来研究 MS ^3,4 的不同方面。在这些模型中，疾病的发生通常是非常人为的，并且人类和小鼠之间临床症状发作的时间范围不同。例如，在人类中，在临床表现出现之前，疾病的病理生理过程多年未被发现。相反，实验者可以在 MS 诱导后的数周甚至数天内检测到动物模型^{的症状 4}.

三种基本动物模型产生多发性硬化症特征的脱髓鞘特征：病毒诱导的特征（例如，泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒）、毒性物质诱导的特征（例如铜酮、溶血卵磷脂）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE^{） 的不同}变体5。每个模型都....

研究方案

本工作中的动物护理和处理是根据 2010^{年 9} 月 22 日欧盟理事会指令 （2010/63/UE） 进行的;本研究中报告的所有程序均已获得意大利卫生部 （407/2018-PR） 和都灵大学伦理委员会（项目编号 360384）的批准。我们建议按照 Kilkenny 等人最初于 2010 年发表的 ARRIVE 指南进行实验设计²⁰.在开始之前，请确保有必要的材料可用（请参阅 材料表）。在高压灭菌器中对用于制备MOG_35-55 乳液的所有玻璃器皿和器皿进行消毒。实验过程的总结如 图1所示。

1. MOG_35-55 乳液的制备

注意：为了制备乳剂，需要MOG_35-55，不完全弗洛伊德佐剂（IFA）， 结核分枝杆 菌菌株H37Ra（MT）和生理溶液（见 材料表）。

注意：热杀灭的 MT 可以刺激先天免疫反应。避免吸入、摄入和接触皮肤和眼睛，使用适当的个人防护装备，并在引擎盖下的有盖精密天平中称量 MT。

讨论

我们描述的 MOG_35-55 诱导的 EAE 方案导致 C57BL/6J 小鼠慢性 MS^{的发展 7,8,13}。在这些具有代表性的结果中，我们报告说，接受免疫程序的男女动物都患上了慢性形式的疾病（即，它们在疾病发作后没有完全恢复，它们积累了缺陷，并且在慢性期保持CS至少为1.5）。

即使许多研究报告该模型^1.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic