두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

요약

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

초록

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 성별에 따라 유병률이 다르고 남성보다 여성에게 더 많은 영향을 미치며 여성보다 남성에서 더 공격적인 형태를 보이는 다른 결과가 특징입니다. 또한 다발성경화증은 임상적 측면, 방사선학적 및 병리학적 특징 측면에서 매우 이질적입니다. 따라서 병리학의 가능한 한 많은 측면을 조사할 수 있는 실험 동물 모델을 활용할 필요가 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 생쥐에서 가장 많이 사용되는 다발성경화증 모델 중 하나로, 면역 체계 활성화에서 중추신경계 손상에 이르기까지 다양한 질병 특징을 모델링합니다. 여기서 우리는 만성 형태의 질병 발병으로 이어지는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG_35-55) 면역을 사용하여 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스 모두에서 EAE 유도를 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 예방 접종 후 28일(28dpi) 동안 이 마우스의 일일 임상 점수 및 운동 성능 평가를 보고합니다. 마지막으로, 질병으로 인한 손상의 주요 부위인 척수에 초점을 맞춘 중추신경계 수준의 몇 가지 기본적인 조직학적 분석을 설명합니다.

서문

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 염증 세포의 혈관 주위 침윤, 탈수초화, 축삭 손실 및 신경교증의 존재를 보여준다¹. 이 병의 원인은 아직 밝혀지지 않았으며, 임상적 측면, 방사선 및 병리학적 특징은 이 질병의 현저한 이질성을 시사한다².

원인이 불분명하고 복잡하기 때문에 현재로서는 인간 MS ^3,4에서 나타나는 모든 임상 및 방사선학적 특징을 요약하는 동물 모델이 없습니다. 그러나 MS ^3,4의 다양한 측면을 연구하기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 이러한 모델에서 질병 시작은 일반적으로 극도로 인위적이며, 임상 징후의 발병 기간은 인간과 생쥐 간에 다릅니다. 예를 들어, 인간의 경우 질병의 기저에 있는 병태생리학적 과정은 임상 증상이 시작되기 전 수년 동안 감지되지 않습니다. 반대로, 실험자는 다발성경화증 유도 후 몇 주 또는 며칠 이내에 동물 모델에서 증상을 감지할 수 있다

프로토콜

본 작업의 동물 관리 및 취급은 2010^{년 9} 월 22 일 유럽 연합 이사회 지침 (2010 / 63 / UE)에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서 보고된 모든 절차는 이탈리아 보건부(407/2018-PR)와 토리노 대학교 윤리위원회(Project n° 360384)의 승인을 받았습니다. 2010년 Kilkenny et al.이 처음 발표한 ARRIVE 가이드라인에 따라 실험 설계를 준수할 것을 제안합니다²⁰. 시작하기 전에 필요한 재료를 사용할 수 있는지 확인하십시오( 재료 표 참조). 오토클레이브에서 MOG_35-55 에멀젼을 준비하는 데 사용되는 모든 유리 제품 및 기구를 멸균합니다. 실험 절차의 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. MOG_35-55 에멀젼의 제조

참고: 에멀젼을 준비하려면 MOG_35-55, 불완전 프로이트 보조제(IFA), Mycobacterium Tuberculosis 균주 H37Ra(MT) 및 생리학적 용액이 필요합니다(....

토론

우리가 기술한 MOG_35-55-유도 EAE 프로토콜은 C57BL/6J 마우스 ^7,8,13에서 만성 형태의 MS를 개발하게 했다. 이러한 대표적인 결과에서, 우리는 예방접종 절차를 거친 암수 동물이 만성적인 형태의 질병을 발병시켰다고 보고했다(즉, 질병 발병 후 완전히 회복되지 않고, 결핍이 누적되며, 만성 단계에서 CS가 1.5 이상을 유지함).<.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic