두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

요약

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

초록

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 성별에 따라 유병률이 다르고 남성보다 여성에게 더 많은 영향을 미치며 여성보다 남성에서 더 공격적인 형태를 보이는 다른 결과가 특징입니다. 또한 다발성경화증은 임상적 측면, 방사선학적 및 병리학적 특징 측면에서 매우 이질적입니다. 따라서 병리학의 가능한 한 많은 측면을 조사할 수 있는 실험 동물 모델을 활용할 필요가 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 생쥐에서 가장 많이 사용되는 다발성경화증 모델 중 하나로, 면역 체계 활성화에서 중추신경계 손상에 이르기까지 다양한 질병 특징을 모델링합니다. 여기서 우리는 만성 형태의 질병 발병으로 이어지는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG_35-55) 면역을 사용하여 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스 모두에서 EAE 유도를 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 예방 접종 후 28일(28dpi) 동안 이 마우스의 일일 임상 점수 및 운동 성능 평가를 보고합니다. 마지막으로, 질병으로 인한 손상의 주요 부위인 척수에 초점을 맞춘 중추신경계 수준의 몇 가지 기본적인 조직학적 분석을 설명합니다.

서문

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 염증 세포의 혈관 주위 침윤, 탈수초화, 축삭 손실 및 신경교증의 존재를 보여준다¹. 이 병의 원인은 아직 밝혀지지 않았으며, 임상적 측면, 방사선 및 병리학적 특징은 이 질병의 현저한 이질성을 시사한다².

원인이 불분명하고 복잡하기 때문에 현재로서는 인간 MS ^3,4에서 나타나는 모든 임상 및 방사선학적 특징을 요약하는 동물 모델이 없습니다. 그러나 MS ^3,4의 다양한 측면을 연구하기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 이러한 모델에서 질병 시작은 일반적으로 극도로 인위적이며, 임상 징후의 발병 기간은 인간과 생쥐 간에 다릅니다. 예를 들어, 인간의 경우 질병의 기저에 있는 병태생리학적 과정은 임상 증상이 시작되기 전 수년 동안 감지되지 않습니다. 반대로, 실험자는 다발성경화증 유도 후 몇 주 또는 며칠 이내에 동물 모델에서 증상을 감지할 수 있다⁴.

세 가지 기본 동물 모델은 다발성경화증의 특징인 탈수초화의 특징을 나타내는데, 바이러스에 의해 유도되는 것(예: Theiler's murine encephalomyelitis virus), 독성 물질에 의해 유도되는 것(예: cuprizone, lysolecithin), 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE^)의 다양한 변이입니다5. 각 모델은 질병의 특정 측면을 연구하는 데 도움이 되지만 MS⁶의 모든 기능을 복제하는 모델은 없습니다. 따라서 특정 실험 요구 사항과 해결해야 할 과학적 질문을 고려하여 올바른 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

미엘린 유래 항원에 대한 면역 절차 덕분에 EAE는 감수성 쥐의 CNS 구성 요소에 대한 자가 면역 반응을 유발하여 유도됩니다. 광범위한 면역병리학적 및 신경병리학적 메커니즘 사이의 상호작용은 면역된 마우스에서 다발성경화증의 주요 병리학적 특성(즉, 염증, 탈수초화, 축삭 손실 및 신경교증)의 발달을 유발합니다 ^7,8. 생쥐는 면역 접종 후 2주쯤 되면 임상 증상을 보이기 시작하며 일반적으로 꼬리에서 사지, 앞다리까지 상행 마비를 보입니다. 임상 점수(즉, 질병 관련 결손의 누적 정량화)는 일반적으로 5^{점 척도7}를 사용하여 평가된다.

단백질 펩티드를 가진 능동적 면역 또는 뇌 생성 T 세포의 수동적 전달은 다른 유전적 배경을 가진 마우스(예: SJL/J, C57BL/6 및 비만-당뇨병(NOD) 마우스)에서 EAE를 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 미엘린 단백질지질 단백질(PLP), 미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)은 일반적으로 면역원이 생성되는 자가 CNS 단백질의 예입니다. 특히, PLP의 면역우성 항원결정기(PLP_139-151)로 면역된 SJL/J 마우스는 재발-완화(RR) 질병 경과를 보이는 반면, 면역우성 MOG_35-55 펩타이드로 면역된 C57BL/6J 마우스는 만성 성질의 EAE를 나타낸다¹. 다발성경화증 진행, 질병에서 B 세포의 역할, 내부 메커니즘 또는 재수초화 연구의 어려움에 대한 정보를 거의 제공하지 않는 것과 같은 몇 가지 한계에도 불구하고 EAE 모델은 자가면역 및 신경염증 과정의 이해에 크게 기여하여 다발성경화증 분야의 지식을 증가시켜 이 질병에 대한 새로운 치료 접근법을 개발할 수 있도록 했습니다^{4, 6}.

본 연구에서 우리는 특정 형태의 활성 EAE, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG_35-55) 유도 형태 9,10,11,12에 초점을 맞췄습니다. MOG_35-55 유도 EAE는 만성 형태의 다발성경화증을 모델링합니다. 면역 접종 후, 마우스는 면역 후 첫 주 이내에 무증상 단계를 거친 다음 일반적으로 면역 후 두 번째 주에 질병이 발생하는 반면, 면역 후 3주에서 4주 사이에는 질병이 만성화되어 누적된 결핍에서 완전히 회복될 가능성이 없습니다 ^7,8,13. 흥미롭게도, 남성과 여성의 질병을 비교한 연구가 더 적음에도 불구하고, 문헌¹⁴에 제시된 대부분의 연구에서 발병률, 질병 발병, 경과 또는 진행에 있어 남성과 여성의 차이가 관찰되지 않았다.

대조적으로, 인간의 경우, 이러한 매개변수는 성적으로 매우 이형적인 것으로 알려져^{있다 2}. 다발성경화증은 남성보다 여성에게 더 많이 발생합니다. 그러나 남성은 일반적으로 더 공격적인 형태의 질병을 앓게 된다². 이 증거는 생식선 호르몬의 본질적이면서도 복잡한 역할을 시사한다¹⁵; 그럼에도 불구하고 병리학에서 성 호르몬의 역할과 작용 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 더욱이, 동물 모델의 데이터는 에스트로겐과 안드로겐이 성별에 따라 병리학의 다른 부위에 긍정적인 영향을 미친다는 아이디어를 뒷받침합니다^16,17.

일부 연구에서는 프로게스테론의 신경보호, 프로수초화 및 항염증 효과가 있다고 제안하고^있으며 , 다발성경화증 환자에 대한 근거는 부족하지만¹⁸ 신경활성 스테로이드(즉, 프레그네놀론, 테트라하이드로프로게스테론, 디하이드로프로게스테론과 같은 신경계에 의한 새로운 합성 스테로이드)도 병리학적 경과에 영향을 미칠 수 있다¹⁹. 종합적으로, 이러한 데이터는 말초신경계와 중추신경계 내부에서 생성되는 성 호르몬이 질병의 발병과 진행에 중요하고 성별에 따라 달라지는 역할을 한다는 생각을 뒷받침합니다. 따라서 본 연구에서는 수컷과 암컷 동물 모두로부터 별도의 데이터를 수집할 것을 촉구합니다.

조직병리학적 관점에서 척수의 백질은 이 모델에서 중추신경계 손상의 주요 부위 역할을 하며, 단핵 염증 침윤 및 탈수초화의 다초점, 합류 영역을 특징으로 한다⁸. 따라서 C57BL/6J 마우스에서 MOG_35-55-유도 EAE 유도를 위한 이 프로토콜을 설명할 때 두 성별의 질병 결과를 고려하고 척수에 관한 몇 가지 조직병리학적 통찰력을 제공할 것입니다.

프로토콜

본 작업의 동물 관리 및 취급은 2010^{년 9} 월 22 일 유럽 연합 이사회 지침 (2010 / 63 / UE)에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서 보고된 모든 절차는 이탈리아 보건부(407/2018-PR)와 토리노 대학교 윤리위원회(Project n° 360384)의 승인을 받았습니다. 2010년 Kilkenny et al.이 처음 발표한 ARRIVE 가이드라인에 따라 실험 설계를 준수할 것을 제안합니다²⁰. 시작하기 전에 필요한 재료를 사용할 수 있는지 확인하십시오( 재료 표 참조). 오토클레이브에서 MOG_35-55 에멀젼을 준비하는 데 사용되는 모든 유리 제품 및 기구를 멸균합니다. 실험 절차의 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. MOG_35-55 에멀젼의 제조

참고: 에멀젼을 준비하려면 MOG_35-55, 불완전 프로이트 보조제(IFA), Mycobacterium Tuberculosis 균주 H37Ra(MT) 및 생리학적 용액이 필요합니다( 재료 표 참조).

주의: 열사멸 MT는 선천성 면역 반응을 자극할 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 후드 아래의 덮개가 있는 정밀 저울에서 MT를 칭량하여 흡입, 섭취 및 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오.

용액	구성	노트
2mg/mL MOG35-55 펩타이드 용액	2mg/mL 농도의 생리학적 용액에 희석된 동결건조된 MOG35-55 펩타이드	이미 희석된 용액을 -80°C에서 보존합니다.
5μg/mL PT 용액	5μg/mL 농도의 생리학적 용액에 희석된 동결건조된 PT.	이미 희석된 용액을 -80°C에서 보존합니다.
유제	각 마우스에 면역을 주입하는 데 필요한 에멀젼의 총 부피는 300μL로 다음과 같이 나뉩니다.	변질이나 오염을 방지하려면 예방 접종 당일에 에멀젼을 준비하십시오.
	200μg/마우스의 MOG35-55 , 즉 100μL의 MOG35-55 2mg/mL 용액.
	생리학적 용액 50μL
	IFA 150μL
	4mg/mL MT, 즉 1.2mg/마우스
생리학적 용액	염화나트륨 0.9%를 증류수에 희석합니다.

표 1: 예방 접종 절차에 사용되는 용액의 구성.

1. 유리 비커에 용액을 준비하고 액체 성분을 먼저 추가하고 마지막으로 MT를 추가합니다.
   참고: 각 마우스를 면역하는 데 필요한 에멀젼의 총 부피는 300μL이며 표 1과 같이 나눕니다. 에멀젼은 점성이 매우 높고 두껍기 때문에 준비 및 주입 절차 중에 특히 몇 마리의 마우스에 대한 용액을 준비할 때 약간의 손실이 있을 수 있습니다. 면역 할 마우스의 수를 최소 1.5-2 배 과대 평가하여 필요한 에멀젼의 최종 부피를 계산하는 것이 좋습니다.
2. 비커를 얼음에 넣고 18G 바늘이 있는 유리 주사기를 사용하여 용액 유화를 시작합니다.
   알림: 에멀젼은 예를 들어 두 개의 에어프리 유리 주사기를 3방향 마개로 연결하고 플런저를 앞뒤로 밀어 용액을 혼합하는 것과 같은 다른 전략을 사용하여 제조할 수도 있습니다(^21,22).
3. 최소 15분 동안 용액을 유화합니다. 일반적으로 30분의 유화로 충분합니다. 에멀젼의 품질을 확인하려면 물로 채워진 투명한 용기에 에멀젼 한 방울을 넣으십시오 : 방울이 구조를 유지하고 손상되지 않으면 에멀젼이 준비된 것입니다.
4. 에멀젼을 면역에 사용할 1mL 주사기 안에 직접 넣고 에멀젼의 두께를 보존하고 변경 또는 오염을 방지하기 위해 사용할 때까지 +4°C에서 보관합니다.

2. 동물 선택 및 면역

1. 동물 선택
   1. 생후 57-6주에 남녀 모두 ~~20g의 최적 체중으로 성인 C6BL/20J 마우스를 선택합니다. 질병에 대한 감수성은 연령과 성별에 따라 다를 수 있으므로 다양한 실험 그룹에 대해 연령 및 성별이 일치하는 마우스를 선택해야 합니다.
      참고: 마우스는 현재 절차가 특정 체중 범위(17-25g)에 최적화되어 있기 때문에 예방 접종 당일에 체중이 비슷해야 합니다.
   2. 사회적 격리를 피하기 위해 동성 동물을 그룹(n = 4-5/케이지)으로 사육하여 22 ± 2°C, 12:12 라이트/다크 사이클(08:00 AM에 점등) 미만의 45cm x 25cm x 15cm 폴리프로필렌 마우스 케이지에서 표준 조건으로 격리합니다. 음식과 물을 즉시 제공합니다.
      참고: 결국, 면역된 동물에서 질병 경과의 잠재적 변동성을 더욱 제한하기 위해, 우리는 또한 충분히 많은 실험군을 형성하는 것을 제안합니다. 또한 EAE 결과의 변화를 결정하는 조건으로 예방 접종 시기를 설명하는 연구 ^8,23이 있습니다. 따라서, 우리는 모든 동물에서 거의 같은 시간에, 바람직하게는 일일 빛/어둠 주기(²³)의 빛 시간 동안에 면역을 실시할 것을 제안한다. 스트레스를 제한하기 위해, 예방 접종일 이전에 동물을 조작하고 귀 깎기 또는 태그와 같은 일일 평가를 위해 쉽게 식별할 수 있도록 표시하는 것이 바람직합니다.
2. 예방접종 수속
   알림: 동물의 스트레스를 최소화하고 예방 접종을 최적화하기 위해 숙련된 조사관이 절차를 수행해야 합니다. 예방접종을 시작하기 전에 기관 동물 관리 및 윤리 위원회 지침에 따라 마취 방법을 선택하십시오. 우리 실험실은 이소플루란으로 간단한 마취를 사용합니다.
   1. 마우스 마취: 마취 유도를 위한 4% 이소플루란과 마취 유지를 위한 1.5-2% 이소플루란. 마취가 효과적일 때까지 기다렸다가 뒷발과 앞발의 발가락 꼬집을 사용하여 마취 수준을 평가합니다. 쥐가 마취되어 있는 동안 눈의 건조를 방지하려면 수의사가 승인한 눈 연고를 사용하십시오.
   2. 외측 꼬리 정맥에 PT 정맥 주사: 혈관 확장제 역할을 하는 에탄올 용액으로 쥐의 꼬리를 부드럽게 막아 정맥을 표시합니다. 꼬리의 두 측면 정맥 중 하나에 초점을 맞추고 30G 바늘이 장착된 0.5mL 주사기를 사용하여 500ng의 PT(즉, 5μg/mL 농도의 생리학적 용액에 희석된 100μL의 PT)를 주입합니다.
   3. MOG_35-55 에멀젼의 피하 주사 : 1G 바늘이 달린 26mL 주사기를 사용하여 이전에 준비한 에멀젼의 피하 주사를 3 회 수행합니다 : 측면의 부분 아래에 2 개, 꼬리 기저부에 1 개. 각 부위에 주입되는 에멀젼의 부피는 100μL이며, 각 마우스에 주입되는 총 에멀젼의 부피는 300μL입니다.
      알림: 예방 접종일은 예방 접종 후 0일(dpi)로 기록됩니다. 48시간 후(즉, 2dpi에서) 이전에 수행한 것과 동일한 PT를 다시 정맥 주사해야 합니다. 마우스 구속 장치를 사용하여 마취 없이 주사를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 동물의 가능한 불편함과 움직임 또는 마우스와 연구자 모두에게 위험을 피하기 위해 예방 접종 절차 동안 마우스의 마취를 유도하고 유지하는 것을 목표로 합니다. 따라서 수술 절차가 없습니다. 그러나 실험 공정을 최적화하려면 이러한 단계에서 적절한 멸균 상태를 유지하고 이러한 절차 후 마우스의 상태를 모니터링하는 것이 중요합니다.
   4. 쥐가 주사에서 회복되었는지 확인하려면 시술 후 깨끗한 케이지에 넣고 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 기다립니다. 쥐가 완전히 회복되면 다른 동물과 함께 집 케이지로 돌려보냅니다.

3. EAE 후속 조치

1. 체중 및 음식 섭취량
   1. BW의 감소는 질병 진행의 지표이기 때문에 전자 정밀 저울을 사용하여 동물의 체중(BW)을 매일 모니터링합니다.
      참고: 이 감소는 동물 보호에 대한 기관 및 윤리 위원회의 지침에 따라 특정 비율을 초과해서는 안 됩니다. 일반적으로 동물이 초기 체중의 20% 이상(즉, 0dpi로 기록된 체중)을 잃으면 인도적 종점의 적용으로 희생되어야 합니다. 안락사 방법은 흡입을 위한 깊은 비가역적 마취(예: 5% 이소플루란)와 참수를 포함합니다.
   2. 동물이 하루에 먹은 음식(g∙^day-1∙^animal-1)인 음식 섭취량(FI)을 모니터링하고, 적어도 일주일에 한 번 특정 용기에 담긴 음식의 양을 측정하고, 두 번의 순차적 측정과 케이지에 있는 동물의 수 사이에 경과된 날 동안 먹은 음식의 양을 나눕니다.
      알림: 이 측정을 통해 평균 음식 섭취량을 추정할 수 있습니다. 팔다리의 마비와 관련된 임상 질병 징후의 출현 및 축적으로 인해 동물이 뒷다리로 단단히 서서 사료 용기나 물병에 닿을 수 없을 때 물 묻은 음식을 우리 바닥에 놓는 것이 좋습니다. 추적 기간 동안 음식 섭취량을 가능한 한 정확하게 평가하기 위해 쥐를 위해 적시기 전에 이 음식의 건조 중량도 측정했습니다.
2. EAE 중 발정 주기성 평가
   1. McLean et ^al.24에 설명된 대로 질 세포학 도말을 평가하여 최소 2주기 동안 발정 주기를 확인합니다. 질 도말 샘플에서 세 가지 일차 세포 유형(핵이 있는 상피 세포, 각질 편평 상피 세포 및 백혈구)의 존재를 기반으로 발정 주기의 단계를 다음과 같이 분류합니다.
      1. 동그랗고 잘 형성된 핵 상피 세포 클러스터의 거의 독점적인 존재를 기반으로 발정으로 분류합니다.
      2. 각질화된 편평 상피 세포의 조밀하게 밀집된 클러스터의 우세한 존재에 따라 발정으로 분류합니다.
      3. 작고 어둡게 염색된 백혈구의 우세한 존재와 각질화된 편평 상피 세포의 작은 존재에 따라 metestrus로 분류합니다.
      4. 조그맣게 염색된 작은 백혈구와 희귀한 각질 편평 상피 세포의 매우 우세한 존재와 함께 핵이 있는 상피 세포의 출현 가능성에 따라 디스트러스로 분류합니다.
         참고: 남녀 모두에서 질병을 평가할 때 발정기로 인한 여성의 변동성을 확인하는 것이 중요합니다. 특히 면역 후 첫 번째 주와 두 번째 주 사이(즉, EAE의 급성 단계 동안)에 발정 주기의 평가에 초점을 맞추는 것이 좋습니다. 예방접종 절차는 이²⁵단계 내에서 발정 주기의 가장 뚜렷한 변화를 일으킨다는 것이 이전에 밝혀졌다. 또한, 동물이 높은 임상 점수(특히 >3)에 도달했을 때 도말 검사를 수행하는 것은 후방 마비와 뒷다리의 긴장도 부족으로 인해 어렵다는 점을 고려하는 것이 중요합니다.
3. 임상 점수
   1. 맹검된 조사관이 매일 동물의 임상 점수를 평가하도록 합니다. 각 동물에게 0에서 5까지의 등급의 점수(표 2 참조)를 할당하여 Racke⁷에 기술된 바와 같이 질병 경과²⁶을 평가한다.
      참고: 체중 감소와 마찬가지로 동물 관리에 대한 기관 및 윤리 위원회의 지침에 따라 임상 점수 증가를 위해서는 인도적인 종점도 필요합니다. 일반적으로 동물이 더 이상 자율적으로 스스로 먹을 수 없는 경우(이것은 일반적으로 동물이 우리가 사용하는 척도에 따라 최소 4점에 도달할 때 발생함) 인도적 종점의 적용으로 희생되어야 합니다.
4. rotarod 시험에 의한 모터 성능 평가
   참고: EAE 진행 평가는 일반적으로 완전히 훈련된 맹검 조사관이 수행하는 임상 점수를 매일 할당하여 수행됩니다. 그러나 질병의 진행에 대한 보다 정량적이고 객관적인 평가가 도움이 될 수 있습니다. 이전 연구²⁶에서, 로타로드 테스트는 면역된 동물의 운동 성능을 측정하기 위해 사용되었다. van den Berg et ^al.27에 의해 기술된 바와 같이, 질병 경과에 대한 보다 정량적이고 정확한 임상적 평가를 위해 로타로드 테스트에 의한 운동 성능 평가는 임상 점수 평가를 지원할 수 있습니다. 자세한 설명은 van den Berg et ^al.27을 참조하십시오.
   1. 생쥐가 1dpi에서 시작하여 희생(즉, 28dpi)까지 매일 로타로드 세션을 받도록 합니다. 각 세션은 로드 속도를 4rpm에서 40rpm으로 선형으로 증가시켜야 하는 단일 300초 세션으로 구성됩니다.
   2. 동물의 점수를 등록합니다. 마우스가 균형을 유지하지 못하고 장치에서 떨어지면 바닥에 떨어져 센서가 작동하고 시간이 기록됩니다. 따라서 성능은 낙하 대기 시간으로 점수가 매겨집니다.

급	임상 징후		묘사
0	건전하다		관찰된 임상 징후 없음. 동물은 정상적인 톤과 꼬리의 움직임을 보여줍니다. 걸려 넘어지지 않고 걷습니다.
0.5	손상된 게이트		동물은 그릴 위를 걷는 동안 여행합니다.
1	축 늘어진 꼬리		꼬리를 기준으로 동물을 집어 올리면 꼬리가 처집니다 (흐릿한 꼬리).
1.5	축 늘어진 꼬리와 손상된 게이트		동물은 축 늘어진 꼬리를 보이며 그릴 위를 걷다가 넘어집니다.
2	운동 실조증		동물은 일단 등을 돌리면 일어서는 데 어려움을 보입니다.
2.5	뒷다리 운동 실조증과 마비		동물은 등을 돌리면 일어설 수 없으며 뒷다리 중 하나의 힘을 잃습니다.
3	뒷다리 마비		동물은 양쪽 뒷다리의 톤을 잃습니다.
3.5	뒷다리 마비 및/또는 앞다리 마비		동물은 뒷다리와 앞다리의 일부를 잃습니다. 사실, 그것은 앞다리의 손아귀에 힘이 없어진 것을 보여줍니다.
4	테트라 마비		동물은 팔다리의 톤을 완전히 잃습니다.
4.5	테트라 마비 및 체온 저하		동물은 팔다리의 톤을 완전히 잃고 체온이 감소합니다 (추움).
5	죽거나 죽거나		동물이 죽어가고 있거나(어떤 자극에도 반응하지 않음) 죽어 있습니다.

표 2: EAE 진행을 평가하는 데 사용되는 임상 점수 시스템.

4. 척수 수준에서 EAE 유도 조직 병리학적 징후 평가

참고: 여기에서는 동물을 희생하고 척수를 채취하여 조직병리학적 분석을 수행하는 절차를 간략하게 보고합니다. 자세한 설명은 참조 ^10,26,28,29를 참조하십시오.

1. 고정 및 조직 샘플링
   참고: 자세한 설명은 참조^10,26을 참조하십시오.
   1. 질병의 만성 단계에서 28dpi로 동물을 희생하십시오.
      1. 깊은 비가역적 마취(Zolazepam 및 Tiletamine 80mg/kg/Xylazine 10mg/kg의 복강 내 주사)로 마우스를 마취합니다.
      2. 생쥐에 식염수 후 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 심혈관 관류합니다.
         알림: PFA를 사용하는 동안 주의하십시오: PFA는 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흡입, 섭취 및 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 분말의 무게를 측정하고 용액을 준비하고 후드 아래에서 관류를 수행합니다.
   2. 척주(³⁰)로부터 척수를 제거한다.
   3. 척수를 4% PFA 용액에 24시간 동안 보관합니다.
   4. 0.01M 식염수 인산염 완충액(PBS)에서 여러 번 세척합니다.
   5. 척수를 파라핀 블록(³⁰)에 끼운다.
2. 조직학적 절차
   참고: 자세한 설명은 Montarolo et ^al.10을 참조하십시오.
   1. 마이크로톰을 사용하여 10μm 두께의 횡방향 척수 절편을 절단하고 젤라틴 코팅 슬라이드에 수집합니다. 마우스 척수 아틀라스(³¹)의 횡방향 단면에 대응하는 도면과 일치하도록 절편 평면의 방향을 정한다.
   2. 섹션³²의 탈파라핀화를 수행합니다.
   3. Hematoxylin과 Eosin³²로 섹션을 염색하십시오.
   4. 섹션³²를 탈수하십시오.
   5. 장착 매체로 섹션을 덮고 화학 후드 아래 실온에서 건조시킵니다.
      참고: 헤마톡실린-에오신 염색은 혈관 주위 염증성 침윤물(PvIIs)²⁶의 존재를 검출할 수 있게 하며, 이는 질병의 징후로 평가된다⁽²⁸).
3. 척수 절편의 정량 분석
   1. 20x 대물렌즈(²⁹)가 있는 디지털 카메라에 연결된 광학 현미경으로 염색된 단면의 이미지를 획득합니다.
   2. 획득한 이미지를 분석^{하여 mm2}당 침투 수로 표현되는 PvII의 수를 구합니다.
      참고: 획득한 이미지를 분석하려면 이미지 분석 소프트웨어를 활용하는 것이 유용합니다. 이 연구에서 제시된 신경병리학적 소견은 전체 척수 수준을 대표하는 마우스당 척수의 10개 완전한 단면(n = 8/그룹)으로 정량화됩니다.

결과

예방 접종 후 EAE 후속 조치
이것은 아래에 설명된 대로 평가되었습니다.

체중 및 음식 섭취량
이원 분산 분석(ANOVA)(독립 변수로서의 성별 및 시간)은 특히 유도 후 2주 이내에 남녀 모두의 EAE 동물의 BW가 감소했음을 보여줍니다(F_(1,57) = 4.952, p < 0.001; 그림 2A). 그러나 BW의 성적 이형성은 항상 유지됩니다(<...

토론

우리가 기술한 MOG_35-55-유도 EAE 프로토콜은 C57BL/6J 마우스 ^7,8,13에서 만성 형태의 MS를 개발하게 했다. 이러한 대표적인 결과에서, 우리는 예방접종 절차를 거친 암수 동물이 만성적인 형태의 질병을 발병시켰다고 보고했다(즉, 질병 발병 후 완전히 회복되지 않고, 결핍이 누적되며, 만성 단계에서 CS가 1.5 이상을 유지함).<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic