АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит является одной из наиболее широко используемых мышиных моделей рассеянного склероза. В текущем протоколе мышей C57BL/6J обоих полов иммунизируют пептидом гликопротеина олигодендроцита миелина, что приводит в основном к восходящему парезу хвоста и конечностей. Здесь мы обсудим протокол индукции и оценки ЭАЭ.

Аннотация

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он характеризуется разной распространенностью среди полов, поражая больше женщин, чем мужчин, и различными исходами, проявляя более агрессивные формы у мужчин, чем у женщин. Кроме того, рассеянный склероз весьма неоднороден по клиническим аспектам, рентгенологическим и патологическим признакам. Таким образом, необходимо воспользоваться экспериментальными животными моделями, позволяющими исследовать как можно больше аспектов патологии. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой одну из наиболее часто используемых моделей рассеянного склероза у мышей, моделирующую различные особенности заболевания, от активации иммунной системы до повреждения ЦНС. В данной работе описан протокол индукции ЭАЭ как у самцов, так и у самок мышей линии C57BL/6J с использованием иммунизации гликопротеинового пептида 35-55 миелина олигодендроцитов (MOG35-55), что приводит к развитию хронической формы заболевания. Мы также сообщаем об оценке ежедневной клинической оценки и двигательной активности этих мышей в течение 28 дней после иммунизации (28 точек на дюйм). Наконец, мы проиллюстрируем некоторые основные гистологические анализы на уровне ЦНС, уделяя особое внимание спинному мозгу как первичному месту повреждения, вызванного заболеванием.

Введение

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он показывает наличие периваскулярной инфильтрации воспалительных клеток, демиелинизации, потери аксонов и глиоза1. Его этиология остается неизвестной, а его клинические аспекты, рентгенологические и патологоанатомические особенности указывают на замечательную гетерогенность заболевания2.

Из-за его неизвестной этиологии и сложности в настоящее время ни одна животная модель не повторяет все клинические и рентгенологические признаки, отображаемые в MS 3,4 человека. Тем не менее, для изучения различных аспектов MS 3,4 используются различные животные модели. В этих моделях инициация заболевания, как правило, является чрезвычайно искусственной, а временные рамки появления клинических признаков у людей и мышей различны. Например, у человека патофизиологические процессы, лежащие в основе заболевания, остаются незамеченными в течение многих лет до появления клинических проявлений. И наоборот, экспериментаторы могут обнаружить симптомы у животных моделей в течение нескольких недель или даже дней после индукции рассеянного склероза4.

Три основные животные модели дают признаки демиелинизации, характерные для рассеянного склероза: те, которые индуцируются вирусом (например, вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера), те, которые индуцируются токсическими агентами (например, купризоном, лизолецитином) и различные варианты экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)5. Каждая модель помогает изучить некоторые специфические аспекты заболевания, но ни одна из них не воспроизводит все особенности рассеянного склероза6. Таким образом, крайне важно выбрать правильную модель с учетом конкретных экспериментальных потребностей и научных вопросов, которые необходимо решить.

Благодаря процедурам иммунизации против антигенов, полученных из миелина, ЭАЭ индуцируется путем запуска аутоиммунного ответа на компоненты ЦНС у восприимчивых мышей. Взаимодействие широкого спектра иммунопатологических и невропатологических механизмов обусловливает развитие основных патологических признаков рассеянного склероза (т.е. воспаления, демиелинизации, потери аксонов и глиоза) у иммунизированных мышей 7,8. У мышей начинают проявляться клинические симптомы примерно на второй неделе после иммунизации и, как правило, наблюдается восходящий паралич от хвоста к конечностям и передним конечностям. Клиническая оценка (т.е. количественная оценка накопления дефицита, связанного с заболеванием) обычно оценивается по 5-балльной шкале7.

Активная иммунизация белком или пептидом или пассивный перенос энцефалитогенных Т-клеток может быть использована для индуцирования ЭАЭ у мышей с различным генетическим фоном (например, SJL/J, C57BL/6 и мышей без ожирения и диабета (NOD). Миелиновый протеолипидный белок (PLP), основной белок миелина (MBP) и гликопротеин олигодендроцитов миелина (MOG) являются примерами собственных белков ЦНС, из которых обычно образуются иммуногены. В частности, у мышей линии SJL/J, иммунизированных иммунодоминантным эпитопом PLP (PLP139−151), развивается рецидивирующе-ремиттирующее (RR) течение болезни, в то время как у мышей линии C57BL/6J, иммунизированных иммунодоминантным пептидом MOG35-55 , отмечается хронический характерЭАЭ 1. Несмотря на некоторые ограничения, такие как предоставление очень малой информации о прогрессировании рассеянного склероза, роли В-клеток в заболевании, механизмах выемки наизнанку или трудностях в изучении ремиелинизации, модели ЭАЭ внесли огромный вклад в понимание аутоиммунных и нейровоспалительных процессов, расширив знания в области рассеянного склероза и, таким образом, позволив разработать новые терапевтические подходы кэтому заболеванию. 6.

В настоящей работе мы сосредоточились на особой форме активного ЭАЭ, миелиновом олигодендроцитарном гликопротеиновом пептиде 35-55 (MOG35-55)-индуцированной форме 9,10,11,12. MOG35-55-индуцированная ЭАЭ моделирует хроническую форму рассеянного склероза. После иммунизации мыши проходят бессимптомную фазу в течение первой недели после иммунизации, затем болезнь обычно возникает в течение второй недели после иммунизации, в то время как между третьей и четвертой неделями после иммунизации болезнь переходит в хроническую форму, без возможности полного выздоровления от накопленного дефицита 7,8,13. Интересно, что в большинстве исследований, представленных в литературе14, не наблюдается различий между мужчинами и женщинами в заболеваемости, начале, течении или прогрессировании заболевания, даже если в меньшем количестве исследований заболевание сравнивается у мужчин и женщин.

Напротив, у людей эти параметры, как известно, имеют сильный половой диморфизм2. Рассеянный склероз чаще поражает женщин, чем мужчин; Однако у мужчин, как правило, развивается более агрессивная формазаболевания2. Эти данные свидетельствуют о существенной, а также сложной роли гонадных гормонов15; Тем не менее, роль и механизм действия половых гормонов при патологии остаются неясными. Более того, данные, полученные на животных моделях, подтверждают идею о том, что как эстрогены, так и андрогены оказывают положительное влияние на различные тракты патологии в зависимости от пола16,17.

Некоторые исследования также предполагают нейропротекторное, промиелинизирующее и противовоспалительное действие прогестерона18 , и, хотя доказательств у пациентов с рассеянным склерозом мало18, нейроактивные стероиды (т.е. de novo синтезированные нервной системой стероиды, такие как прегненолон, тетрагидропрогестерон и дигидропрогестерон) также могут влиять на течение патологии19. В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что половые гормоны, вырабатываемые как периферически, так и внутри ЦНС, играют важную и специфичную для пола роль в возникновении и прогрессировании заболевания. Поэтому в настоящей работе мы призываем к сбору раздельных данных как от самцов, так и от самок животных.

С гистопатологической точки зрения белое вещество спинного мозга служит основным местом повреждения ЦНС в этой модели, которая характеризуется мультифокальными, сливающимися областями мононуклеарной воспалительной инфильтрации и демиелинизации8. Таким образом, описывая этот протокол индукции MOG35-55-индуцированной ЭАЭ у мышей C57BL/6J, мы примем во внимание исход заболевания у обоих полов и предоставим некоторые гистопатологические сведения о спинном мозге.

протокол

Уход за животными и обращение с ними в данной работе осуществлялось в соответствии с Директивой Совета Европейского Союза от 22сентября 2010 г. (2010/63/UE); все процедуры, о которых сообщалось в настоящем исследовании, были одобрены Министерством здравоохранения Италии (407/2018-PR) и Этическим комитетом Туринского университета (проект No 360384). Мы предлагаем привести план эксперимента в соответствие с руководящими принципами ARRIVE, первоначально опубликованными Kilkenny et al. в 2010 г.20. Перед началом работы убедитесь в наличии необходимых материалов (см. Таблицу материалов). Стерилизовать всю стеклянную посуду и приборы, используемые для приготовления эмульсии MOG35-55 , в автоклаве. Краткое изложение экспериментальных процедур представлено на рисунке 1.

1. Приготовление эмульсии MOG35-55

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления эмульсии необходимы MOG35-55, неполный адъювант Фрейда (IFA), штамм Mycobacterium Tuberculosis H37Ra (MT) и физиологический раствор (см. таблицу материалов).

ВНИМАНИЕ: Термически убитый МТ может стимулировать врожденный иммунный ответ. Избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей и глазами, используя надлежащие средства индивидуальной защиты и взвешивая MT на закрытых прецизионных весах под капотом.

РешениеСоставПримечания
2 мг/мл раствор пептида MOG35-55 Лиофилизированный пептид MOG35-55, разбавленный физиологическим раствором в концентрации 2 мг/млХраните уже разбавленный раствор при температуре -80 °C.
Раствор PT 5 мкг/млЛиофилизированный ПТ разводят в физиологическом растворе в концентрации 5 мкг/мл.Храните уже разбавленный раствор при температуре -80 °C.
ЭмульсияОбщий объем эмульсии, необходимый для каждой иммунизируемой мыши, составляет 300 мкл, разделенный следующим образом:Во избежание перебоев или загрязнения приготовьте эмульсию в день иммунизации.
200 мкг/мышь MOG35-55 , т.е. 100 мкл MOG35-55 2 мг/мл раствора.
50 мкл физиологического раствора
150 мкл ИФА
4 мг/мл МТ, т.е. 1,2 мг/мышь
Физиологическое решениеХлорид натрия 0,9% разводят в дистиллированной воде.

Таблица 1: Состав растворов, используемых для процедуры иммунизации.

  1. Приготовьте раствор в стеклянной мензурке, добавив сначала жидкий компонент и, наконец, МТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем эмульсии, необходимый для каждой иммунизируемой мыши, составляет 300 мкл, разделенный, как указано в таблице 1. Эмульсия очень вязкая и густая, поэтому во время процедуры приготовления и инъекции могут быть некоторые потери, особенно при приготовлении раствора для нескольких мышей. Окончательный объем необходимой эмульсии мы предлагаем рассчитать, завысив количество мышей, подлежащих иммунизации, не менее чем в 1,5-2 раза.
  2. Поместите стакан в лед и с помощью стеклянного шприца с иглой 18 G начните эмульгировать раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсию можно приготовить и другими способами, например, соединив два безвоздушных стеклянных шприца с трехходовым запорным краном и перемешав раствор, толкая плунжеры вперед и назад21,22.
  3. Эмульгировать раствор не менее 15 мин; Как правило, достаточно 30 минут эмульгирования. Чтобы проверить качество эмульсии, добавьте каплю эмульсии в прозрачную емкость, наполненную водой: если капля сохранит свою структуру и останется целой, эмульсия готова.
  4. Поместите эмульсию непосредственно в шприцы объемом 1 мл, которые будут использоваться для иммунизации, и храните их при температуре +4 °C до использования, чтобы сохранить густоту эмульсии и избежать изменений или загрязнений.

2. Селекция и иммунизация животных

  1. Селекция животных
    1. Отбор взрослых мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте 8-10 недель с оптимальной массой тела ~20 г. Обязательно выбирайте мышей соответствующего возраста и пола для разных экспериментальных групп, потому что восприимчивость к болезням может варьироваться в зависимости от возраста и пола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны иметь сопоставимую массу тела в день иммунизации, поскольку данная процедура оптимизирована для определенного диапазона массы тела (17-25 г).
    2. Содержать однополых животных группами (n = 4-5 на клетку), чтобы избежать социальной изоляции в стандартных условиях, в полипропиленовых клетках для мышей размером 45 см x 25 см x 15 см при температуре 22 ± 2 °C, при цикле свет/темнота 12:12 (свет включается в 08:00 утра). Обеспечьте еду и воду вволю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном итоге, чтобы еще больше ограничить потенциальную вариабельность течения болезни у иммунизированных животных, мы также предлагаем сформировать достаточно многочисленные экспериментальные группы. Существуют также исследования 8,23, в которых сроки иммунизации описываются как условие, определяющее вариабельность исхода ЭАЭ. Таким образом, мы предлагаем проводить иммунизацию примерно в один и тот же час у всех животных, предпочтительно в световые часы суточного цикла свет/темнота23. Чтобы ограничить стресс, предпочтительно манипулировать животными до дня иммунизации и помечать их, чтобы их можно было легко идентифицировать для ежедневной оценки, например, обрезания ушей или метки.
  2. Процедура иммунизации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что процедура выполняется опытным исследователем, чтобы свести к минимуму стресс для животных и оптимизировать иммунизацию. Перед началом иммунизации выберите метод анестезии в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по уходу за животными и этики. В нашей лаборатории используется кратковременная анестезия изофлураном.
    1. Обезболивайте мышь: 4% изофлуран для индукции анестезии и 1,5-2% изофлуран для поддержания анестезии. Подождите, пока анестезия не начнет действовать, и используйте щипки задней и передней ног, чтобы оценить уровень анестезии. Чтобы предотвратить сухость глаз, пока мышь находится под наркозом, используйте одобренную ветеринаром глазную мазь.
    2. Внутривенная инъекция ПТ в латеральную каудальную вену: осторожно заткните хвост мыши раствором этанола, который действует как сосудорасширяющее средство, чтобы вывести вены. Сосредоточьтесь на одной из двух боковых вен хвоста и с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 30 G введите 500 нг ПТ (т.е. 100 мкл ПТ, разведенного в физиологическом растворе в концентрации 5 мкг/мл).
    3. Подкожное введение эмульсии MOG35-55 : с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 G выполнить три подкожных инъекции ранее приготовленной эмульсии: две под ростральную часть боков и одну у основания хвоста. Объем эмульсии, вводимой в каждый участок, составляет 100 мкл, при этом общий объем эмульсии составляет 300 мкл, вводимый в каждую мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День иммунизации записывается как день 0 после иммунизации (dpi); Через 48 ч (т.е. при 2 dpi) необходимо выполнить еще одно внутривенное введение ПТ, равное предыдущему. Возможно проведение инъекции без анестезии, с использованием ограничителя мыши. Процедура, описанная здесь, направлена на индуцирование и поддержание анестезии мышей во время процедуры иммунизации, чтобы избежать возможного дискомфорта и движений животных или рисков как для мышей, так и для исследователей. Таким образом, хирургических вмешательств не проводится. Однако для оптимизации экспериментальных процессов важно поддерживать надлежащие стерильные условия во время этих этапов и следить за состоянием мыши после этих процедур.
    4. Чтобы убедиться, что мышь выздоровела после инъекций, поместите ее в чистую клетку после процедур и подождите, пока она не придет в сознание настолько, чтобы сохранить лежачее положение грудины. После того, как мышь полностью выздоровеет, верните ее в домашнюю клетку вместе с другими животными.

3. Последующее наблюдение за ЭАЭ

  1. Масса тела и потребление пищи
    1. Ежедневно контролируйте массу тела (МТ) животных с помощью электронных прецизионных весов, потому что снижение массы тела является индикатором прогрессирования заболевания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижение не должно превышать определенного процента, в соответствии с руководящими принципами институционального и этического комитета по уходу за животными. Обычно, если животное теряет более 20% от первоначальной массы тела (т.е. веса, зарегистрированного при 0 dpi), оно должно быть принесено в жертву в качестве применения гуманной конечной точки. Методы эвтаназии предполагают глубокую необратимую анестезию для ингаляции (например, 5% изофлурана) с последующим обезглавливанием.
    2. Следите за потреблением пищи (FI) - пищей, съеденной животным за день (г∙день-1∙животное-1), взвешивая количество пищи в конкретном контейнере не реже одного раза в неделю и деля количество съеденного корма за дни, прошедшие между двумя последовательными измерениями, и количество животных, присутствующих в клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это измерение позволяет оценить среднее потребление пищи. Из-за появления и накопления клинических признаков заболевания, которые включают паралич конечностей, мы рекомендуем класть немного поилки корма на пол клетки, когда животные не могут твердо стоять на задних конечностях и дотянуться до контейнера с кормом или бутылки с водой. Чтобы как можно точнее оценить потребление пищи в течение периода наблюдения, мы также измерили сухой вес этого корма перед тем, как смачивать его мышам.
  2. Оценка эстральной цикличности при ЭАЭ
    1. Проверяйте эстральный цикл в течение, по крайней мере, двух циклов, оценивая мазки из влагалища, как описано McLean et al.24. Классифицируйте фазы эстрального цикла на основе наличия трех первичных типов клеток — ядрообразных эпителиальных клеток, ороговевших плоских эпителиальных клеток и лейкоцитов — в образцах мазка из влагалища, следующим образом:
      1. Классифицируют как проэструсы на основании почти исключительного наличия скоплений округлых, хорошо сформированных ядрообразных эпителиальных клеток.
      2. Классифицируют как течку на основании преобладающего присутствия плотно упакованных скоплений ороговевших плоских эпителиальных клеток.
      3. Классифицируют как метеструс на основании преобладающего присутствия мелких темно окрашенных лейкоцитов и незначительного присутствия ороговевших плоских эпителиальных клеток.
      4. Классифицируют как диэструс на основании преобладающего присутствия мелких темных лейкоцитов и редких ороговевших плоских эпителиальных клеток, а также возможного появления ядросодержащих эпителиальных клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При оценке заболевания у обоих полов важно проверить вариабельность у самок, обусловленную эстральным циклом. Мы предлагаем сосредоточиться на оценке эстрального цикла, особенно между первой и второй неделями после иммунизации (т.е. во время острой фазы ЭАЭ). Ранее было показано, что процедура иммунизации вызывает наиболее выраженные изменения эстрального цикла в рамкахэтой фазы 25. Кроме того, важно учитывать, что выполнение мазка при достижении животным высокого клинического балла (особенно >3) затруднено из-за заднего пареза и отсутствия тонуса в задних конечностях.
  3. Клиническая оценка
    1. Попросите слепого исследователя ежедневно оценивать клинические показатели животных. Присвойте каждому животному оценку от 0 до 5 баллов (см. таблицу 2) для оценки течения болезни26 , как описано в Racke7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае со снижением массы тела, гуманная конечная точка также необходима для увеличения клинических показателей, в соответствии с руководящими принципами институционального и этического комитета по уходу за животными. Как правило, если животное больше не способно питаться самостоятельно (обычно это происходит, когда животное достигает по крайней мере 4 баллов, в соответствии с используемой нами шкалой), оно должно быть принесено в жертву в качестве применения гуманной конечной точки.
  4. Оценка производительности двигателя с помощью теста rotarod
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка прогрессирования ЭАЭ обычно выполняется путем ежедневного присвоения клинической оценки, что делается полностью обученным слепым исследователем. Тем не менее, было бы полезно дополнить его более количественной и объективной оценкой прогрессирования заболевания. В предыдущем исследовании26 тест ротарода использовался для измерения двигательных показателей иммунизированных животных. Как описано van den Berg et al.27, для более количественной и точной клинической оценки течения заболевания оценка двигательных функций с помощью теста ротарода может поддержать оценку клинической оценки. Подробное описание см. van den Berg et al.27.
    1. Пусть мыши проходят сеансы ротарода ежедневно, начиная с 1 dpi до жертвоприношения (т.е. 28 dpi). Каждый сеанс состоит из одного сеанса продолжительностью 300 с, в течение которого скорость стержня должна линейно увеличиваться от 4 до 40 об/мин.
    2. Зарегистрируйте баллы животного. Когда мышь не в состоянии удерживать равновесие и падает с устройства, она падает на землю и срабатывает датчик, а время (с) записывается. Таким образом, производительность оценивается как задержка до падения (s).

СтепеньКлинический признакОписание
0ЗдоровыйКлинических признаков не наблюдается. Животное демонстрирует нормальный тонус и движение хвоста. Он ходит, не спотыкаясь.
0.5Повреждение воротЖивотное спотыкается во время прогулки по мангалу.
1Хромой хвостКогда животное подхватывают за основание хвоста, хвост обвисает (дряблый хвост).
1.5Хромающий хвост и поврежденные воротаЖивотное показывает дряблый хвост, и оно спотыкается во время прогулки по грилю.
2АтаксияЖивотное с трудом встает после того, как его перевернули на спину.
2.5Атаксия и парез задних конечностейЖивотное не может встать, если его перевернуть на спину, и оно теряет тонус одной из своих задних конечностей.
3Паралич задних конечностейЖивотное теряет тонус обеих задних конечностей.
3.5Паралич задних конечностей и/или парез передних конечностейЖивотное теряет тонус как задних конечностей, так и частично передних. На самом деле, это показывает потерю силы в хватке передних конечностей.
4ТетрапарезЖивотное полностью теряет тонус конечностей.
4.5Тетрапарез и снижение температуры телаЖивотное полностью теряет тонус конечностей, и у него наблюдается снижение температуры тела (ему холодно).
5Умирающий или мертвыйЖивотное умирает (не реагирует ни на один раздражитель) или мертво.

Таблица 2: Клиническая балльная система, используемая для оценки прогрессирования ЭАЭ.

4. Оценка ЭАЭ-индуцированных гистопатологических признаков на уровне спинного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы кратко сообщаем о процедуре жертвоприношения животных и сбора спинного мозга для проведения гистопатологического анализа; Подробное описание см. в ссылках 10,26,28,29.

  1. Фиксация и забор тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание см. в ссылках10,26.
    1. Приносите в жертву животных при 28 dpi во время хронической фазы заболевания.
      1. Обезболивайте мышей глубокой необратимой анестезией (внутрибрюшинная инъекция Золазепама и Тилетамина 80 мг/кг / Ксилазина 10 мг/кг).
      2. Транскардиально перфузируют мышей физиологическим раствором, а затем 4% раствором параформальдегида (PFA).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при использовании PFA: поскольку он токсичен, избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей и глазами, используя надлежащие средства индивидуальной защиты. Взвесьте порошок, приготовьте раствор и выполните перфузию под колпаком.
    2. Извлеките спинной мозг из позвоночного столба30.
    3. Храните спинной мозг в 4% растворе PFA в течение 24 ч.
    4. Выполните несколько промывок в 0,01 М солевом фосфатном буфере (PBS).
    5. Встраивают спинной мозг в парафиновые блоки30.
  2. Гистологические процедуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание см. в Montarolo et al.10.
    1. С помощью микротома вырежьте поперечные срезы спинного мозга толщиной 10 мкм и соберите их на предметные стекла, покрытые желатином. Сориентируйте плоскость сечения в соответствии с чертежами, соответствующими поперечным сечениям мыши атласа спинного мозга31.
    2. Выполнить депарафинизацию секций32.
    3. Окрасьте срез гематоксилином и эозином32.
    4. Обезвоживайте секции32.
    5. Накройте срезы монтажной средой и дайте им высохнуть при комнатной температуре под химическим колпаком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание гематоксилин-эозином позволяет обнаружить наличие периваскулярных воспалительных инфильтратов (PvIIs)26, что оценивается как признак заболевания28.
  3. Количественный анализ срезов спинного мозга
    1. Получение изображений окрашенных срезов с помощью оптического микроскопа, подключенного к цифровой камере с 20-кратным объективом29.
    2. Проанализируйте полученное изображение, чтобы получить количество PvII, выраженное как количество инфильтратов намм2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа полученных изображений полезно воспользоваться программным обеспечением для анализа изображений. Невропатологические находки, представленные в этой работе, количественно оцениваются в 10 полных поперечных срезах спинного мозга на мышь (n = 8/группа), что соответствует уровням всего спинного мозга.

Результаты

Наблюдение за ЭАЭ после иммунизации
Это было оценено так, как описано ниже.

Масса тела и потребление пищи
Двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) (пол и время как независимые переменные) показывают снижение МТ ЭАЭ животных обоих полов, особенно в теч...

Обсуждение

Описанный нами протокол ЭАЭ, индуцированный MOG35-55, привел к развитию хронической формы рассеянного склероза у мышей C57BL/6J 7,8,13. В этих репрезентативных результатах мы сообщили, что у животных обоего пола, прошедших процедуру иммуни...

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеет конфликта интересов, который можно было бы заявить в отношении исследования, авторства и/или публикации данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - проектом MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 и 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини; Фонд Кавальери-Оттоленги, Орбассано, Италия. BB был стипендиатом INFRA-P, регион Пьемонт (n.378-35) (2022-2023) и PRIN 2020 - 20203AMKTW. Мы благодарим Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) за поддержку. Плата за публикацию была поддержана любезным пожертвованием Distretto Rotaract 2031 и, в частности, Rotaract Club Torino Nord-Est. Мы благодарим Элейн Миллер за корректуру нашей рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscopeNIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balanceMerckMod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin YSigma-AldrichHT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 mlSacco System L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)VWR213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)Sigma-AldrichMHS32Filter before using it. 
Image analysis SoftwareFiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)Sigma-AldrichF5506Store at +4 °C. 
IsofluraneWellona PharmaThis drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J miceJackson Laboratory, EnvigoAge 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
MicrotomeLeica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium Merck107961
Mouse RotarodUgo Basile #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra Difco Laboratories Inc. 231141Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscopeNIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT)Duotech PT.181Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)B. EurospitalA 032182038Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)Thermo ScientificJ61196.AP
Software for image acquisition NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needlePIC20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyesLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunThis mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and TiletamineZoletil  100This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic

Ссылки

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

200MOG35 55EAEC57BL 6J35 55 MOG35 55

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены