Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie ist gekennzeichnet durch eine unterschiedliche Prävalenz in den Geschlechtern, von denen mehr Frauen als Männer betroffen sind, und durch unterschiedliche Verläufe, die bei Männern aggressivere Formen aufweisen als bei Frauen. Darüber hinaus ist MS sehr heterogen in Bezug auf klinische Aspekte, radiologische und pathologische Merkmale. Daher ist es notwendig, experimentelle Tiermodelle zu nutzen, die es ermöglichen, so viele Aspekte der Pathologie wie möglich zu untersuchen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) stellt eines der am häufigsten verwendeten MS-Modelle bei Mäusen dar und modelliert verschiedene Krankheitsmerkmale, von der Aktivierung des Immunsystems bis hin zu ZNS-Schäden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von EAE in männlichen und weiblichen C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptid-35-55-Immunisierung (MOG_35-55), die zur Entwicklung einer chronischen Form der Krankheit führt. Wir berichten auch über die Auswertung des täglichen klinischen Scores und der motorischen Leistung dieser Mäuse für 28 Tage nach der Immunisierung (28 dpi). Abschließend erläutern wir einige grundlegende histologische Analysen auf ZNS-Ebene, wobei wir uns auf das Rückenmark als primären Ort der krankheitsbedingten Schädigung konzentrieren.

Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Es zeigt das Vorhandensein einer perivaskulären Infiltration von Entzündungszellen, Demyelinisierung, axonalen Verlust und Gliose¹. Die Ätiologie ist nach wie vor unbekannt, und ihre klinischen Aspekte, Röntgen- und pathologischen Merkmale deuten auf eine bemerkenswerte Heterogenität der Erkrankung hin².

Aufgrund der unbekannten Ätiologie und Komplexität gibt es derzeit kein Tiermodell, das alle klinischen und radiologischen Merkmale der humanen MS rekapituliert

Protokoll

Die Pflege und Handhabung der Tiere in der vorliegenden Arbeit erfolgte gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Union vom 22^. September 2010 (2010/63/EU); Alle in der vorliegenden Studie berichteten Verfahren wurden vom italienischen Gesundheitsministerium (407/2018-PR) und von der Ethikkommission der Universität Turin (Projekt Nr. 360384) genehmigt. Wir schlagen vor, das Versuchsdesign an die ARRIVE-Richtlinien anzupassen, die ursprünglich von Kilkenny et al. im Jahr 2010 veröffentlicht wurden²⁰. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Materialien verfügbar sind (siehe Materialtabelle....

Diskussion

Das von uns beschriebene MOG_{35-55-induzierte EAE-Protokoll} führte zur Entwicklung einer chronischen Form der MS in C57BL/6J-Mäusen ^7,8,13. In diesen repräsentativen Ergebnissen berichteten wir, dass die Tiere beiderlei Geschlechts, die sich der Immunisierung unterzogen hatten, eine chronische Form der Krankheit entwickelten (d.h. sie erholen sich nach Ausbruch der Krankheit nicht vollständig, sie akkumulieren Defi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic