Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie ist gekennzeichnet durch eine unterschiedliche Prävalenz in den Geschlechtern, von denen mehr Frauen als Männer betroffen sind, und durch unterschiedliche Verläufe, die bei Männern aggressivere Formen aufweisen als bei Frauen. Darüber hinaus ist MS sehr heterogen in Bezug auf klinische Aspekte, radiologische und pathologische Merkmale. Daher ist es notwendig, experimentelle Tiermodelle zu nutzen, die es ermöglichen, so viele Aspekte der Pathologie wie möglich zu untersuchen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) stellt eines der am häufigsten verwendeten MS-Modelle bei Mäusen dar und modelliert verschiedene Krankheitsmerkmale, von der Aktivierung des Immunsystems bis hin zu ZNS-Schäden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von EAE in männlichen und weiblichen C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptid-35-55-Immunisierung (MOG_35-55), die zur Entwicklung einer chronischen Form der Krankheit führt. Wir berichten auch über die Auswertung des täglichen klinischen Scores und der motorischen Leistung dieser Mäuse für 28 Tage nach der Immunisierung (28 dpi). Abschließend erläutern wir einige grundlegende histologische Analysen auf ZNS-Ebene, wobei wir uns auf das Rückenmark als primären Ort der krankheitsbedingten Schädigung konzentrieren.

Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Es zeigt das Vorhandensein einer perivaskulären Infiltration von Entzündungszellen, Demyelinisierung, axonalen Verlust und Gliose¹. Die Ätiologie ist nach wie vor unbekannt, und ihre klinischen Aspekte, Röntgen- und pathologischen Merkmale deuten auf eine bemerkenswerte Heterogenität der Erkrankung hin².

Aufgrund der unbekannten Ätiologie und Komplexität gibt es derzeit kein Tiermodell, das alle klinischen und radiologischen Merkmale der humanen MS rekapituliert ^3,4. Es werden jedoch verschiedene Tiermodelle verwendet, um verschiedene Aspekte von MS ^3,4 zu untersuchen. In diesen Modellen ist die Initiierung der Krankheit in der Regel extrem künstlich, und der Zeitrahmen für das Auftreten klinischer Symptome ist zwischen Menschen und Mäusen unterschiedlich. Beim Menschen beispielsweise bleiben die pathophysiologischen Prozesse, die der Krankheit zugrunde liegen, jahrelang unentdeckt, bevor klinische Manifestationen auftreten. Umgekehrt können die Experimentatoren Symptome im Tiermodell innerhalb von Wochen oder sogar Tagen nach der MS-Induktion feststellen⁴.

Drei grundlegende Tiermodelle zeigen die für MS charakteristischen Merkmale der Demyelinisierung: virusinduzierte (z. B. Theiler-murine Enzephalomyelitis-Virus), solche, die durch toxische Wirkstoffe induziert werden (z. B. Cuprizon, Lysolecithin) und die verschiedenen Varianten der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)⁵. Jedes Modell hilft bei der Untersuchung einiger spezifischer Facetten der Krankheit, aber keines repliziert alle Merkmale von MS⁶. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, das richtige Modell unter Berücksichtigung der spezifischen experimentellen Anforderungen und der zu beantwortenden wissenschaftlichen Fragen auszuwählen.

Dank Immunisierungsverfahren gegen Myelin-abgeleitete Antigene wird EAE durch das Auslösen einer Autoimmunantwort auf ZNS-Komponenten in anfälligen Mäusen induziert. Das Zusammenspiel zwischen einer Vielzahl von immunpathologischen und neuropathologischen Mechanismen führt bei den immunisierten Mäusen zur Entwicklung der wichtigsten pathologischen Merkmale der MS (d. h. Entzündung, Demyelinisierung, axonaler Verlust und Gliose) ^7,8. Mäuse zeigen etwa in der zweiten Woche nach der Impfung klinische Symptome und zeigen in der Regel eine aufsteigende Lähmung vom Schwanz bis zu den Gliedmaßen und Vordergliedmaßen. Der klinische Score (d.h. die Quantifizierung der Anhäufung krankheitsbedingter Defizite) wird in der Regel anhand einer 5-Punkte-Skala⁷ bewertet.

Eine aktive Immunisierung mit Protein oder Peptid oder ein passiver Transfer von enzephalitogenen T-Zellen kann verwendet werden, um EAE bei Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund (z. B. SJL/J, C57BL/6 und nicht-adipös-diabetische (NOD) Mäuse) zu induzieren. Das Myelin-Proteolipidprotein (PLP), das Myelin-Basisprotein (MBP) und das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) sind Beispiele für Selbst-ZNS-Proteine, aus denen normalerweise Immunogene hergestellt werden. Insbesondere SJL/_J-Mäuse, die mit dem immundominanten Epitop von PLP (PLP₁₃₉−₁₅₁) immunisiert wurden, entwickeln einen schubförmig-remittierenden (RR) Krankheitsverlauf, während C57BL/6J-Mäuse, die mit dem immundominanten MOG_35-55-Peptid immunisiert wurden, EAE chronischer Natur zeigen¹. Trotz einiger Einschränkungen, wie z.B. sehr wenig Informationen über das Fortschreiten der MS, die Rolle der B-Zellen in der Krankheit, die Inside-Out-Mechanismen oder Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Remyelinisierung, haben die EAE-Modelle enorm zum Verständnis von Autoimmun- und neuroinflammatorischen Prozessen beigetragen, das Wissen auf dem Gebiet der MS erweitert und so die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Krankheit ermöglicht^{4. 6}. Anmelden

In der vorliegenden Arbeit konzentrierten wir uns auf eine bestimmte Form von aktivem EAE, das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid 35-55 (MOG_35-55)-induzierte Form ^9,10,11,12. Die MOG_{35-55-induzierte} EAE modelliert eine chronische Form der MS. Nach der Immunisierung durchlaufen die Mäuse innerhalb der ersten Woche nach der Immunisierung eine asymptomatische Phase, dann tritt die Krankheit typischerweise in der zweiten Woche nach der Immunisierung auf, während die Krankheit zwischen der dritten und vierten Woche nach der Immunisierung chronisch wird, ohne dass eine vollständige Genesung von den angesammelten Defiziten möglich^{ist 7,8,13}. Interessanterweise werden in den meisten der in der Literatur vorhandenen Studien keine Unterschiede zwischen Männern und Frauen in Bezug auf Inzidenz, Krankheitsbeginn, -verlauf oder -progression beobachtet¹⁴, auch wenn weniger Studien die Krankheit bei Männern und Frauen vergleichen.

Im Gegensatz dazu sind diese Parameter beim Menschen als stark sexuell dimorph^{bekannt 2}. MS betrifft mehr Frauen als Männer; Männer entwickeln jedoch in der Regel eine aggressivere Form der Krankheit². Diese Beweise deuten auf eine wesentliche und komplexe Rolle der Gonadenhormone hin¹⁵; Dennoch sind die Rolle und der Wirkmechanismus von Sexualhormonen in der Pathologie noch unklar. Darüber hinaus unterstützen Daten aus Tiermodellen die Idee, dass sowohl Östrogene als auch Androgene auf geschlechtsspezifische Weise positive Auswirkungen auf verschiedene Bereiche der Pathologie ausüben^16,17.

Einige Studien deuten auch auf neuroprotektive, promyelinisierende und entzündungshemmende Wirkungen von Progesteron^{hin 18} , und obwohl die Evidenz bei MS-Patienten spärlich ist¹⁸, könnten neuroaktive Steroide (d. h. de novo synthetisierte Steroide des Nervensystems, wie Pregnenolon, Tetrahydroprogesteron und Dihydroprogesteron) auch den pathologischen Verlauf beeinflussen¹⁹. Zusammengenommen unterstützen diese Daten die Idee, dass Sexualhormone, die sowohl peripher als auch im ZNS produziert werden, eine wichtige und geschlechtsspezifische Rolle beim Ausbruch und Fortschreiten der Krankheit spielen. Daher drängen wir in der vorliegenden Arbeit darauf, getrennte Daten sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren zu sammeln.

Aus histopathologischer Sicht dient die weiße Substanz des Rückenmarks als Hauptlokalisation der ZNS-Schädigung in diesem Modell, das durch multifokale, konfluente Regionen mononukleärer entzündlicher Infiltration und Demyelinisierung gekennzeichnet ist⁸. Bei der Beschreibung dieses Protokolls zur Induktion von MOG_{35-55-induzierter} EAE in C57BL/6J-Mäusen werden wir daher den Krankheitsverlauf bei beiden Geschlechtern berücksichtigen und einige histopathologische Einblicke in das Rückenmark geben.

Protokoll

Die Pflege und Handhabung der Tiere in der vorliegenden Arbeit erfolgte gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Union vom 22^. September 2010 (2010/63/EU); Alle in der vorliegenden Studie berichteten Verfahren wurden vom italienischen Gesundheitsministerium (407/2018-PR) und von der Ethikkommission der Universität Turin (Projekt Nr. 360384) genehmigt. Wir schlagen vor, das Versuchsdesign an die ARRIVE-Richtlinien anzupassen, die ursprünglich von Kilkenny et al. im Jahr 2010 veröffentlicht wurden²⁰. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Materialien verfügbar sind (siehe Materialtabelle). Sterilisieren Sie alle Gläser und Utensilien, die für die Herstellung der MOG_{35-55-Emulsion} verwendet werden, in einem Autoklaven. Eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Herstellung der MOG_35-55 Emulsion

HINWEIS: Zur Herstellung der Emulsion sind MOG_35-55, ein unvollständiges Freud-Adjuvans (IFA), Mycobacterium tuberculosis-Stamm H37Ra (MT) und eine physiologische Lösung erforderlich (siehe Materialtabelle).

VORSICHT: Hitzeabgetötete MT kann die angeborene Immunantwort stimulieren. Vermeiden Sie das Einatmen, Verschlucken und den Kontakt mit Haut und Augen, verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und wiegen Sie MT in einer abgedeckten Präzisionswaage unter der Haube.

Lösung	Zusammensetzung	Notizen
2 mg/ml MOG35-55 Peptidlösung	Gefriergetrocknetes MOG35-55-Peptid, verdünnt in physiologischer Lösung in einer Konzentration von 2 mg/ml	Konservieren Sie die bereits verdünnte Lösung bei -80 °C.
5 μg/ml PT-Lösung	Gefriergetrocknetes PT, verdünnt in physiologischer Lösung mit einer Konzentration von 5 μg/ml.	Konservieren Sie die bereits verdünnte Lösung bei -80 °C.
Emulsion	Das Gesamtvolumen der Emulsion, die für jede zu immunisierende Maus benötigt wird, beträgt 300 μl, aufgeteilt wie folgt:	Um Veränderungen oder Kontaminationen zu vermeiden, bereiten Sie die Emulsion am Tag der Immunisierung vor.
	200 μg/Maus MOG35-55 , d. h. 100 μl MOG35-55 2 mg/ml-Lösung.
	50 μl physiologische Lösung
	150 μl IFA
	4 mg/ml MT, d. h. 1,2 mg/Maus
Physiologische Lösung	Natriumchlorid 0,9% verdünnt in destilliertem Wasser.

Tabelle 1: Zusammensetzung der für das Impfverfahren verwendeten Lösungen.

1. Bereiten Sie die Lösung in einem Glasbecherglas vor, indem Sie zuerst die flüssige Komponente und schließlich das MT hinzufügen.
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Emulsion, die für jede zu immunisierende Maus benötigt wird, beträgt 300 μl, aufgeteilt wie in Tabelle 1 angegeben. Die Emulsion ist sehr viskos und dickflüssig, so dass es während des Präparations- und Injektionsverfahrens zu einem gewissen Verlust kommen kann, insbesondere bei der Herstellung der Lösung für einige Mäuse. Wir schlagen vor, das endgültige Volumen der benötigten Emulsion zu berechnen, indem die Anzahl der zu immunisierenden Mäuse um mindestens das 1,5-2-fache überschätzt wird.
2. Stellen Sie das Becherglas in Eis und verwenden Sie die Glasspritze mit einer 18-G-Nadel, um die Lösung zu emulgieren.
   ANMERKUNG: Die Emulsion kann auch mit anderen Strategien hergestellt werden, z. B. durch Verbinden der beiden luftfreien Glasspritzen mit einem Dreiwegehahn und Mischen der Lösung durch Hin- und Herschieben der Kolben^21,22.
3. Emulgieren Sie die Lösung für mindestens 15 Minuten; In der Regel reichen 30 Minuten Emulgierung aus. Um die Qualität der Emulsion zu überprüfen, geben Sie einen Tropfen Emulsion in einen transparenten, mit Wasser gefüllten Behälter: Wenn der Tropfen seine Struktur behält und intakt bleibt, ist die Emulsion fertig.
4. Geben Sie die Emulsion direkt in die 1-ml-Spritzen, die für die Immunisierung verwendet werden, und lagern Sie diese bis zur Verwendung bei +4 °C, um die Dicke der Emulsion zu erhalten und Veränderungen oder Verunreinigungen zu vermeiden.

2. Tierselektion und Immunisierung

1. Auswahl der Tiere
   1. Wählen Sie erwachsene C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 8-10 Wochen mit einem optimalen Körpergewicht von ~20 g aus. Achten Sie darauf, alters- und geschlechtsgleiche Mäuse für verschiedene Versuchsgruppen auszuwählen, da die Anfälligkeit für Krankheiten je nach Alter und Geschlecht variieren kann.
      HINWEIS: Mäuse sollten am Tag der Impfung ein vergleichbares Körpergewicht haben, da das vorliegende Verfahren für einen bestimmten Körpergewichtsbereich (17-25 g) optimiert ist.
   2. Halten Sie gleichgeschlechtliche Tiere in Gruppen (n = 4-5/Käfig), um eine soziale Isolation unter Standardbedingungen in 45 cm x 25 cm x 15 cm großen Polypropylen-Mäusekäfigen bei 22 ± 2 °C zu vermeiden, unter 12:12 Hell/Dunkel-Zyklus (Licht an um 08:00 Uhr). Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zur Verfügung.
      ANMERKUNG: Um die potentielle Variabilität des Krankheitsverlaufs bei den immunisierten Tieren weiter einzuschränken, schlagen wir auch vor, ausreichend zahlreiche Versuchsgruppen zu bilden. Es gibt auch Studien ^8,23, die den Zeitpunkt der Immunisierung als eine Bedingung beschreiben, die die Variation des EAE-Ergebnisses bestimmt. Daher schlagen wir vor, die Immunisierung bei allen Tieren ungefähr zur gleichen Stunde durchzuführen, vorzugsweise während der Lichtstunden des täglichen Hell-Dunkel-Zyklus²³. Um den Stress zu begrenzen, ist es vorzuziehen, die Tiere vor dem Tag der Impfung zu manipulieren und sie zu markieren, um sie für die tägliche Auswertung leicht identifizieren zu können, z. B. durch Ohrclipping oder Markierung.
2. Das Impfverfahren
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Verfahren von einem erfahrenen Prüfarzt durchgeführt wird, um den Stress für die Tiere zu minimieren und die Immunisierung zu optimieren. Bevor Sie mit der Impfung beginnen, wählen Sie die Anästhesiemethode in Übereinstimmung mit den Richtlinien der institutionellen Tierpflege und der Ethikkommission. Unser Labor verwendet eine Kurzanästhesie mit Isofluran.
   1. Betäuben Sie die Maus: 4 % Isofluran für die Anästhesieeinleitung und 1,5-2 % Isofluran für die Aufrechterhaltung der Anästhesie. Warten Sie, bis die Anästhesie wirksam ist, und drücken Sie die Zehen hinten und vorne ein, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen. Um das Austrocknen der Augen während der Narkose der Maus zu verhindern, verwenden Sie eine vom Tierarzt zugelassene Augensalbe.
   2. PT intravenöse Injektion in die laterale kaudale Vene: Verstopfen Sie den Schwanz der Maus vorsichtig mit einer Ethanollösung, die als Vasodilatator wirkt, um die Venen sichtbar zu machen. Konzentrieren Sie sich auf eine der beiden seitlichen Venen des Schwanzes und injizieren Sie mit einer 0,5-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel 500 ng PT (d. h. 100 μl PT, verdünnt in physiologischer Lösung mit einer Konzentration von 5 μg/ml).
   3. Subkutane Injektion der MOG_{35-55-Emulsion} : Führen Sie mit der 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel drei subkutane Injektionen der zuvor hergestellten Emulsion durch: zwei unter den rostralen Teil der Flanken und eine an den Schwanzansatz. Das Volumen der Emulsion, die an jeder Stelle injiziert wird, beträgt 100 μl, was einem Gesamtvolumen von 300 μl Emulsion entspricht, die in jede Maus injiziert wird.
      HINWEIS: Der Tag der Impfung wird als Tag 0 nach der Immunisierung (dpi) aufgezeichnet. 48 Stunden später (d.h. bei 2 dpi) ist es notwendig, eine weitere intravenöse Injektion von PT durchzuführen, die der zuvor durchgeführten entspricht. Es ist möglich, die Injektion ohne Anästhesie mit einem Maushalter durchzuführen. Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, die Betäubung der Mäuse während des Immunisierungsverfahrens zu induzieren und aufrechtzuerhalten, um mögliche Beschwerden und Bewegungen der Tiere oder Risiken sowohl für Mäuse als auch für Prüfer zu vermeiden. Somit gibt es keine chirurgischen Eingriffe. Um die experimentellen Abläufe zu optimieren, ist es jedoch wichtig, während dieser Schritte angemessene sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten und den Zustand der Maus nach diesen Eingriffen zu überwachen.
   4. Um zu überprüfen, ob sich die Maus von den Injektionen erholt hat, setzen Sie sie nach den Eingriffen in einen sauberen Käfig und warten Sie, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein zu halten. Nachdem sich die Maus vollständig erholt hat, setzen Sie sie mit anderen Tieren in den häuslichen Käfig zurück.

3. EAE-Follow-up

1. Körpergewicht und Nahrungsaufnahme
   1. Überwachen Sie täglich das Körpergewicht (KG) der Tiere mit einer elektronischen Präzisionswaage, da die Abnahme des BW ein Indikator für das Fortschreiten der Krankheit ist.
      HINWEIS: Dieser Rückgang sollte gemäß den Richtlinien des institutionellen und ethischen Komitees für die Tierpflege einen bestimmten Prozentsatz nicht überschreiten. Wenn ein Tier mehr als 20 % des ursprünglichen Körpergewichts verliert (d. h. das bei 0 dpi gemessene Gewicht), sollte es in der Regel als Anwendung des humanen Endpunkts geopfert werden. Die Euthanasie-Methoden beinhalten eine tiefe irreversible Anästhesie zur Inhalation (z. B. 5% Isofluran) mit anschließender Enthauptung.
   2. Überwachen Sie die Nahrungsaufnahme (FI) - das Futter, das ein Tier an einem Tag (g∙^Tag-1∙^Tier-1) gefressen hat, wiegen Sie die Futtermenge in dem spezifischen Behälter mindestens einmal pro Woche und teilen Sie die Menge des gefressenen Futters für die verstrichenen Tage auf zwei aufeinanderfolgende Messungen und die Anzahl der im Käfig vorhandenen Tiere auf.
      HINWEIS: Diese Messung ermöglicht die Schätzung der durchschnittlichen Nahrungsaufnahme. Aufgrund des Auftretens und der Häufung klinischer Krankheitssymptome, die mit einer Lähmung der Gliedmaßen einhergehen, empfehlen wir, etwas getränktes Futter auf den Boden des Käfigs zu legen, wenn die Tiere nicht in der Lage sind, fest auf ihren Hinterbeinen zu stehen und den Futterbehälter oder die Wasserflasche zu erreichen. Um die Nahrungsaufnahme während der Nachbeobachtungszeit so genau wie möglich beurteilen zu können, haben wir auch das Trockengewicht dieses Futters gemessen, bevor wir es für die Mäuse benetzt haben.
2. Bewertung der Östruszyklizität während der EAE
   1. Überprüfen Sie den Östruszyklus für mindestens zwei Zyklen und werten Sie die vaginalen zytologischen Abstriche aus, wie von McLean et ^al.24 beschrieben. Klassifizieren Sie die Phase des Brunstzyklus basierend auf dem Vorhandensein von drei primären Zelltypen - kernhaltige Epithelzellen, verhornte Plattenepithelzellen und Leukozyten - in den vaginalen Abstrichproben wie folgt:
      1. Die Klassifizierung als Proöstrus basiert auf einem fast ausschließlichen Vorhandensein von Clustern von runden, gut ausgebildeten kernhaltigen Epithelzellen.
      2. Die Klassifizierung als Brunst basiert auf dem vorherrschenden Vorhandensein dicht gepackter Cluster von verhornten Plattenepithelzellen.
      3. Die Klassifizierung als Metestrus basiert auf dem überwiegenden Vorhandensein kleiner, dunkel gefärbter Leukozyten und dem geringen Vorhandensein von verhornten Plattenepithelzellen.
      4. Die Klassifizierung als diestrus basiert auf dem überwiegenden Vorhandensein von kleinen, dunkel gefärbten Leukozyten und seltenen verhornten Plattenepithelzellen zusammen mit dem möglichen Auftreten von kernhaltigen Epithelzellen.
         HINWEIS: Bei der Beurteilung der Erkrankung bei beiden Geschlechtern ist es wichtig, die Variabilität bei Frauen aufgrund des Brunstzyklus zu überprüfen. Wir empfehlen, sich auf die Bewertung des Brunstzyklus zu konzentrieren, insbesondere zwischen der ersten und der zweiten Woche nach der Immunisierung (d. h. während der akuten Phase der EAE). Es wurde bereits gezeigt, dass das Immunisierungsverfahren innerhalb dieser Phase die stärksten Veränderungen des Östruszyklus verursacht²⁵. Darüber hinaus ist es wichtig zu bedenken, dass die Durchführung des Abstrichs, wenn das Tier einen hohen klinischen Wert (insbesondere >3) erreicht, aufgrund der hinteren Parese und des fehlenden Tonus in den Hintergliedmaßen schwierig ist.
3. Klinischer Score
   1. Lassen Sie einen verblindeten Prüfarzt täglich den klinischen Score der Tiere bewerten. Weisen Sie jedem Tier eine Punktzahl von 0 bis 5 zu (siehe Tabelle 2), um den Krankheitsverlauf²⁶ zu bewerten, wie in Racke⁷ beschrieben.
      HINWEIS: Ähnlich wie bei der Abnahme des Körpergewichts ist auch für die Erhöhung der klinischen Werte ein humaner Endpunkt erforderlich, gemäß den Richtlinien des institutionellen und ethischen Komitees für die Tierpflege. Wenn ein Tier nicht mehr in der Lage ist, sich selbstständig zu ernähren (dies geschieht normalerweise, wenn ein Tier mindestens die Punktzahl 4 erreicht, gemäß der von uns verwendeten Skala), sollte dies als Anwendung des humanen Endpunkts geopfert werden.
4. Bewertung der Motorleistung durch Rotarod-Test
   HINWEIS: Die Bewertung der EAE-Progression erfolgt in der Regel durch tägliche Zuweisung des klinischen Scores, die von einem vollständig ausgebildeten, verblindeten Prüfarzt durchgeführt wird. Es könnte jedoch sinnvoll sein, sie mit einer quantitativeren und objektiveren Bewertung des Krankheitsverlaufs zu flankieren. In einer früheren Studie²⁶ wurde der Rotarod-Test verwendet, um die motorische Leistungsfähigkeit der immunisierten Tiere zu messen. Wie von van den Berg et ^al.27 beschrieben, kann die Bewertung der motorischen Leistung durch den Rotarod-Test die Beurteilung des klinischen Scores unterstützen, um eine quantitativere und präzisere klinische Bewertung des Krankheitsverlaufs zu erhalten. Für eine detaillierte Beschreibung siehe van den Berg et ^al.27.
   1. Lassen Sie die Mäuse täglich Rotarod-Sitzungen durchführen, beginnend mit 1 dpi bis zur Opferung (d. h. 28 dpi). Jede Sitzung besteht aus einer einzigen 300-Sekunden-Sitzung, bei der die Rutendrehzahl linear von 4 auf 40 U/min erhöht werden muss.
   2. Registrieren Sie die Punktzahl des Tieres. Wenn die Maus nicht in der Lage ist, ihr Gleichgewicht zu halten und vom Gerät fällt, fällt sie auf den Boden und löst einen Sensor aus, und die Zeit(en) wird aufgezeichnet. Somit wird die Leistung als Latenz zum Fallen(n) gewertet.

Grad	Klinisches Zeichen		Beschreibung
0	Gesund		Keine beobachteten klinischen Symptome. Das Tier zeigt einen normalen Tonus und eine Bewegung des Schwanzes. Er läuft, ohne zu stolpern.
0.5	Beeinträchtigtes Tor		Das Tier stolpert beim Laufen auf einem Grill.
1	Schlaffer Schwanz		Wenn das Tier an der Basis des Schwanzes aufgenommen wird, hängt der Schwanz herunter (schlaffer Schwanz).
1.5	Limpender Schwanz und beeinträchtigtes Tor		Das Tier zeigt einen schlaffen Schwanz und stolpert beim Gehen auf einem Grill.
2	Ataxie		Das Tier zeigt Schwierigkeiten beim Aufstehen, sobald es auf den Rücken gedreht wurde.
2.5	Ataxie und Parese der Hintergliedmaßen		Das Tier kann nicht mehr aufstehen, sobald es auf den Rücken gedreht wurde, und es verliert den Tonus eines seiner Hintergliedmaßen.
3	Lähmung der Hintergliedmaßen		Das Tier verliert den Tonus beider Hintergliedmaßen.
3.5	Lähmung der Hintergliedmaßen und/oder Parese der Vordergliedmaßen		Das Tier verliert den Tonus beider Hintergliedmaßen und teilweise der Vordergliedmaßen. Tatsächlich zeigt es einen Kraftverlust im Griff der Vordergliedmaßen.
4	Tetra-Parese		Das Tier verliert vollständig den Tonus seiner Gliedmaßen.
4.5	Tetraparese und verminderte Körpertemperatur		Das Tier verliert vollständig den Tonus seiner Gliedmaßen und zeigt eine Abnahme der Körpertemperatur (es ist kalt).
5	Sterbend oder tot		Das Tier liegt im Sterben (es reagiert auf keinen Reiz) oder ist tot.

Tabelle 2: Klinisches Scoring-System zur Beurteilung der EAE-Progression.

4. Evaluation von EAE-induzierten histopathologischen Symptomen auf Rückenmarksebene

HINWEIS: Hier berichten wir kurz über das Verfahren zur Opferung der Tiere und zur Entnahme des Rückenmarks, um eine histopathologische Analyse durchzuführen. Eine detaillierte Beschreibung finden Sie in den Referenzen 10,26,28,29.

1. Fixierung und Gewebeentnahme
   HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung finden Sie in diesen Referenzen^10,26.
   1. Opfern Sie die Tiere während der chronischen Phase der Krankheit mit 28 dpi.
      1. Anästhesie der Mäuse durch tiefe irreversible Anästhesie (intraperitoneale Injektion von Zolazepam und Tiletamin 80 mg/kg / Xylazin 10 mg/kg).
      2. Transkardiale Perfusion der Mäuse mit einer Kochsalzlösung, gefolgt von einer 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung.
         HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Verwendung von PFA: Da es giftig ist, vermeiden Sie das Einatmen, Verschlucken und den Kontakt mit Haut und Augen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Wiegen Sie das Pulver, bereiten Sie die Lösung vor und führen Sie die Perfusion unter der Haube durch.
   2. Entfernen Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule³⁰.
   3. Lagern Sie das Rückenmark 24 Stunden lang in einer 4%igen PFA-Lösung.
   4. Führen Sie mehrere Wäschen in 0,01 M Salzphosphatpuffer (PBS) durch.
   5. Das Rückenmark in Paraffinblöcke einbetten³⁰.
2. Histologische Verfahren
   HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung finden Sie unter Montarolo et ^al.10.
   1. Mit einem Mikrotom 10 μm dicke Querschnitte des Rückenmarks schneiden und auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern sammeln. Richten Sie die Schnittebene so aus, dass sie mit den Zeichnungen übereinstimmt, die den Querschnitten des Rückenmarksatlas³¹ der Maus entsprechen.
   2. Führen Sie die Entparaffinierung der Abschnitte³² durch.
   3. Färben Sie den Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin³².
   4. Dehydrieren Sie die Abschnitte³².
   5. Decken Sie die Abschnitte mit einem Eindeckmedium ab und lassen Sie sie bei Raumtemperatur unter einer chemischen Haube trocknen.
      ANMERKUNG: Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung ermöglicht den Nachweis des Vorhandenseins von perivaskulären entzündlichen Infiltraten (PvIIs⁾²⁶, die als Zeichen der Krankheit bewertet werden²⁸.
3. Quantitative Analyse von Rückenmarksschnitten
   1. Erfassen Sie Bilder der gefärbten Schnitte mit einem optischen Mikroskop, das an eine Digitalkamera mit einem 20-fach-Objektiv^{angeschlossen ist 29}.
   2. Analysieren Sie das aufgenommene Bild, um die Anzahl der PvIIs zu erhalten, ausgedrückt als Anzahl der Infiltrate pro^mm2.
      HINWEIS: Für die Analyse der aufgenommenen Bilder ist es sinnvoll, die Vorteile einer Bildanalysesoftware zu nutzen. Die in dieser Arbeit vorgestellten neuropathologischen Befunde werden in 10 vollständigen Querschnitten des Rückenmarks pro Maus (n = 8/Gruppe) quantifiziert, die repräsentativ für das gesamte Rückenmark sind.

Ergebnisse

EAE-Nachsorge nach der Immunisierung
Dies wurde wie nachfolgend beschrieben bewertet.

Körpergewicht und Nahrungsaufnahme
Die bidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) (Geschlecht und Zeit als unabhängige Variablen) zeigt eine Abnahme des BW von EAE-Tieren beiderlei Geschlechts, insbesondere innerhalb der zweiten Woche nach der Induktion (F_(1,57) = 4,952, p < 0,001; Abbildung 2A). Der Sexualdimorphi...

Diskussion

Das von uns beschriebene MOG_{35-55-induzierte EAE-Protokoll} führte zur Entwicklung einer chronischen Form der MS in C57BL/6J-Mäusen ^7,8,13. In diesen repräsentativen Ergebnissen berichteten wir, dass die Tiere beiderlei Geschlechts, die sich der Immunisierung unterzogen hatten, eine chronische Form der Krankheit entwickelten (d.h. sie erholen sich nach Ausbruch der Krankheit nicht vollständig, sie akkumulieren Defi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic