إنشاء نموذج فسيولوجي للأورام الدقيقة الوعائية البشرية لأبحاث السرطان

Summary

يقدم هذا البروتوكول نموذجا ذا صلة من الناحية الفسيولوجية للورم على الرقاقة لإجراء أبحاث السرطان البشري الأساسية والتحويلية عالية الإنتاجية ، وتطوير فحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ومناهج الطب الشخصي مع وصف لإجراءات التحميل والصيانة والتقييم.

Abstract

لا يزال الافتقار إلى نماذج السرطان التي تم التحقق من صحتها والتي تلخص البيئة المكروية للورم للسرطانات الصلبة في المختبر يمثل عنق زجاجة كبير لأبحاث السرطان قبل السريرية والتطوير العلاجي. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير الورم المجهري الوعائي (VMT) ، أو رقاقة الورم ، وهو نظام فسيولوجي دقيق يقوم بشكل واقعي بنمذجة البيئة المكروية المعقدة للورم البشري. يتشكل VMT من جديد داخل منصة الموائع الدقيقة من خلال الزراعة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا البشرية في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي الديناميكي. يشتمل هذا البناء الهندسي للورم الدقيق المصمم على الأنسجة على شبكة أوعية دموية حية تدعم كتلة الورم المتنامية تماما كما تفعل الأوعية المشكلة حديثا في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، يجب أن تعبر الأدوية والخلايا المناعية الطبقة البطانية للوصول إلى الورم ، ونمذجة الحواجز الفسيولوجية في الجسم الحي أمام التسليم العلاجي والفعالية. نظرا لأن منصة VMT شفافة بصريا ، يمكن تحقيق تصوير عالي الدقة للعمليات الديناميكية مثل تسرب الخلايا المناعية وورم خبيث من خلال التصور المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية داخل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يحتفظ VMT بعدم تجانس الورم في الجسم الحي ، وتوقيعات التعبير الجيني ، والاستجابات الدوائية. يمكن تكييف أي نوع من الأورام تقريبا مع المنصة ، وتنمو الخلايا الأولية من الأنسجة الجراحية الطازجة وتستجيب للعلاج الدوائي في VMT ، مما يمهد الطريق نحو الطب الشخصي حقا. هنا ، يتم تحديد طرق إنشاء VMT واستخدامه لأبحاث الأورام. يفتح هذا النهج المبتكر إمكانيات جديدة لدراسة الأورام والاستجابات الدوائية ، مما يوفر للباحثين أداة قوية لتطوير أبحاث السرطان.

Introduction

لا يزال السرطان مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في الولايات المتحدة. بالنسبة لعام 2023 وحده ، يتوقع المركز الوطني للإحصاءات الصحية حدوث أكثر من 1.9 مليون حالة سرطان جديدة وأكثر من 600000 حالة وفاة بالسرطان في الولايات المتحدة¹ ، مما يسلط الضوء على الحاجة الملحة لنهج علاجية فعالة. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، فإن 5.1٪ فقط من العلاجات المضادة للسرطان التي تدخل التجارب السريرية تحصل في النهاية على موافقة إدارة الغذاء والدواء. يمكن أن يعزى فشل المرشحين الواعدين في التقدم بنجاح من خلال التجارب السريرية جزئيا إلى استخدام أنظمة النماذج غير الفسيولوجية ، مثل 2D والثقافات الكروية ، أثناء تطوير الأدوية قبل السريرية

Protocol

1. التصميم والتصنيع

1. تصميم الجهاز
   1. لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة ، قم بإنشاء قالب SU-8 باستخدام طبقة 200 ميكرومتر من SU-8 المغلفة بالدوران على رقاقة Si (RCA-1 تنظيفها و 2٪ فلوريد الهيدروجين (HF)) ، متبوعة بخطوة طباعة حجرية ضوئية لقناع واحد كما هو موضح سابقا ^8,9.
   2. قم بصب نسخة طبق الأصل من البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) بسمك 4 مم من قالب SU-8 لإنشاء قالب بولي يوريثين متين لخطوات التصنيع النهائية. يمكن استخدام تكرارات التصميم المختلفة^8،9،10،11

النتائج

باتباع البروتوكولات الموضحة هنا ، تم إنشاء VMOs و VMTs باستخدام EC و NHLF المشتراة تجاريا ، وبالنسبة ل VMT ، خط خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي MDA-MB-231. كما تم دمج VMOs الراسخة مع الخلايا السرطانية لتقليد ورم خبيث. في كل نموذج ، بحلول اليوم 5 من الثقافة المشتركة ، تتجمع شبكة الأوعية الدموية ذاتيا استجا?.......

Discussion

يتلقى كل نسيج في الجسم تقريبا العناصر الغذائية والأكسجين من خلال الأوعية الدموية ، مما يجعله مكونا حاسما لنمذجة المرض الواقعية وفحص الأدوية في المختبر. علاوة على ذلك ، يتم تعريف العديد من الأورام الخبيثة وحالات المرض من خلال خلل وظيفي في بطانة الأوعية الدموية وفرط النفاذية^.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003