Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Özet

Bu protokol, yükleme, bakım ve değerlendirme prosedürlerinin bir açıklamasıyla birlikte yüksek verimli temel ve translasyonel insan kanseri araştırmaları, gelişmiş ilaç taraması, hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları gerçekleştirmek için fizyolojik olarak ilgili bir çip üzerinde tümör modeli sunar.

Özet

Solid kanserlerin tümör mikroçevresini in vitro olarak özetleyen doğrulanmış kanser modellerinin eksikliği, klinik öncesi kanser araştırmaları ve terapötik geliştirme için önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, karmaşık insan tümör mikroçevresini gerçekçi bir şekilde modelleyen mikrofizyolojik bir sistem olan vaskülarize mikrotümörü (VMT) veya tümör çipini geliştirdik. VMT, dinamik, fizyolojik akış koşulları altında birden fazla insan hücresi tipinin birlikte kültürlenmesiyle mikroakışkan bir platform içinde de novo oluşturur. Bu doku mühendisliği mikro-tümör yapısı, tıpkı yeni oluşan damarların in vivo olarak yaptığı gibi, büyüyen tümör kitlesini destekleyen canlı bir perfüze vasküler ağ içerir. Daha da önemlisi, ilaçlar ve bağışıklık hücreleri, tümöre ulaşmak için endotel tabakasını geçmeli, terapötik uygulama ve etkinlik için in vivo fizyolojik engelleri modellemelidir. VMT platformu optik olarak şeffaf olduğundan, doku içindeki floresan etiketli hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile immün hücre ekstravazasyonu ve metastaz gibi dinamik süreçlerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi sağlanabilir. Ayrıca, VMT in vivo tümör heterojenliğini, gen ekspresyon imzalarını ve ilaç yanıtlarını korur. Hemen hemen her tümör tipi platforma uyarlanabilir ve taze cerrahi dokulardan elde edilen birincil hücreler büyür ve VMT'de ilaç tedavisine yanıt vererek gerçekten kişiselleştirilmiş tıbbın yolunu açar. Burada, VMT'yi kurma ve onkoloji araştırmaları için kullanma yöntemleri özetlenmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tümörleri ve ilaç yanıtlarını incelemek için yeni olanaklar sunarak araştırmacılara kanser araştırmalarını ilerletmek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Kanser dünya çapında önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde ikinci önde gelen ölüm nedenidir. Ulusal Sağlık İstatistikleri Merkezi, yalnızca 2023 yılı için ABD'de 1,9 milyondan fazla yeni kanser vakası ve 600.000'den fazla kanser ölümünün meydana gelmesini öngörüyor¹ ve etkili tedavi yaklaşımlarına olan acil ihtiyacı vurguluyor. Bununla birlikte, şu anda, klinik araştırmalara giren anti-kanser terapötiklerinin yalnızca% 5.1'i nihayetinde FDA onayı almaktadır. Gelecek vaat eden adayların klinik çalışmalarda başarılı bir şekilde ilerleyememesi, kısmen klinik öncesi ilaç geliştirme sırasında 2D ve sfero....

Protokol

1. Tasarım ve imalat

1. Cihaz tasarımı
   1. Mikroakışkan cihaz üretimi için, bir Si-gofret (RCA-8 temizlenmiş ve% 200 hidrojen florür (HF) ile muamele edilmiş) üzerine 2 μm spin kaplı SU-1 tabakası kullanarak bir SU-2 kalıbı oluşturun,^{ardından daha önce} açıklandığı gibi tek bir maske fotolitografi adımı ^8,9.
   2. Sonraki imalat adımları için dayanıklı bir poliüretan kalıp oluşturmak için SU-8 kalıbından 4 mm kalınlığında bir polidimetilsiloksan (PDMS) replikası dökün. Çeşitli tasarım yinelemeleri^{kullanılabilir} 8,9,10,11,12,13,14,15.

Tartışmalar

Vücuttaki hemen hemen her doku, damar sistemi yoluyla besin ve oksijen alır, bu da onu gerçekçi hastalık modellemesi ve in vitro ilaç taraması için kritik bir bileşen haline getirir. Ayrıca, çeşitli maligniteler ve hastalık durumları vasküler endotel disfonksiyonu ve hiperpermeabilite ile tanımlanır³. Özellikle, kanserde, tümörle ilişkili damar sistemi genellikle kötü perfüze edilir, bozulur ve sızdırır, bu nedenle tümöre terapötik ve bağışıklık hücresi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003