Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Zusammenfassung

Der Mangel an validierten Krebsmodellen, die die Tumormikroumgebung solider Krebsarten in vitro rekapitulieren, stellt nach wie vor einen erheblichen Engpass für die präklinische Krebsforschung und die therapeutische Entwicklung dar. Um dieses Problem zu lösen, haben wir den vaskularisierten Mikrotumor (VMT) oder Tumorchip entwickelt, ein mikrophysiologisches System, das die komplexe Mikroumgebung des menschlichen Tumors realistisch modelliert. Die VMT bildet sich de novo innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durch Co-Kultur mehrerer humaner Zelltypen unter dynamischen, physiologischen Strömungsbedingungen. Dieses Gewebe-Engineering-Mikrotumor-Konstrukt enthält ein lebendes, durchblutetes Gefäßnetzwerk, das die wachsende Tumormasse genauso unterstützt, wie es neu gebildete Gefäße in vivo tun. Wichtig ist, dass Medikamente und Immunzellen die Endothelschicht überwinden müssen, um den Tumor zu erreichen, wodurch physiologische Barrieren für die therapeutische Verabreichung und Wirksamkeit in vivo modelliert werden. Da die VMT-Plattform optisch transparent ist, kann eine hochauflösende Bildgebung dynamischer Prozesse wie Immunzellextravasation und Metastasierung mit direkter Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen innerhalb des Gewebes erreicht werden. Darüber hinaus behält die VMT in vivo die Tumorheterogenität, die Genexpressionssignaturen und das Ansprechen auf Medikamente bei. Praktisch jeder Tumortyp kann an die Plattform angepasst werden, und Primärzellen aus frischem chirurgischem Gewebe wachsen und sprechen auf die medikamentöse Behandlung in der VMT an, was den Weg zu einer wirklich personalisierten Medizin ebnet. Hier werden die Methoden zur Etablierung des VMT und dessen Nutzung für die onkologische Forschung skizziert. Dieser innovative Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Tumoren und Arzneimittelreaktionen und gibt Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug an die Hand, um die Krebsforschung voranzutreiben.

Einleitung

Krebs ist nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem weltweit und die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Allein für das Jahr 2023 rechnet das National Center for Health Statistics mit mehr als 1,9 Millionen neuen Krebsfällen und über 600.000 Krebstodesfällen in den USA¹, was den dringenden Bedarf an wirksamen Behandlungsansätzen unterstreicht. Derzeit erhalten jedoch nur 5,1 % der Krebstherapeutika, die sich in klinischen Studien befinden, letztendlich eine FDA-Zulassung. Das Scheitern vielversprechender Kandidaten, klinische Studien erfolgreich zu durchlaufen, kann teilweise auf die Verwendung nicht-physiologischer Modells....

Protokoll

1. Design und Herstellung

1. Geräte-Design
   1. Für die Herstellung von mikrofluidischen Geräten wird eine SU-8-Form mit einer 200-μm-Schicht aus SU-8 hergestellt, die auf einen Si-Wafer aufgetragen wird (RCA-1 gereinigt und mit 2 % Fluorwasserstoff (HF) behandelt), gefolgt von einem Photolithographieschritt mit einer einzigen Maske, wie zuvor beschrieben ^8,9.
   2. Gießen Sie eine 4 mm dicke Polydimethylsiloxan (PDMS)-Replik aus der SU-8-Form, um eine langlebige Polyurethanform für nachgelagerte Fertigungsschritte zu erzeugen. Es können verschiedene Design-Iterationen verwendet ....

Diskussion

Fast jedes Gewebe im Körper erhält Nährstoffe und Sauerstoff über das Gefäßsystem, was es zu einer kritischen Komponente für eine realistische Krankheitsmodellierung und ein Arzneimittelscreening in vitro macht. Darüber hinaus werden verschiedene Malignome und Krankheitszustände durch vaskuläre endotheliale Dysfunktion und Hyperpermeabilität definiert³. Bemerkenswert ist, dass bei Krebs das tumorassoziierte Gefäßsystem oft schlecht durchblutet, gestört und undicht ist, was a.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003