JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) ، وهي نوع من الخلايا داخل الجمجمة تم تحديده مؤخرا ، لها وظائف غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قابلا للتكرار لحصاد LLECs من الفئران وإنشاء مزارع أولية في المختبر . تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين الباحثين من الخوض في الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة ل LLECs.

Abstract

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) هي مجموعة خلوية داخل الجمجمة تم اكتشافها مؤخرا مع توزيع فريد متميز بوضوح عن الخلايا البطانية اللمفاوية الطرفية. وظيفتها الخلوية وآثارها السريرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توافر إمدادات من LLECs أمر ضروري لإجراء البحوث الوظيفية في المختبر. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول قائم لحصاد وزراعة LLECs في المختبر.

نجحت هذه الدراسة في حصاد LLECs باستخدام بروتوكول متعدد الخطوات ، والذي تضمن طلاء القارورة بالفبرونيكتين ، وتشريح الليبتومينيات بمساعدة المجهر ، وهضم الليبتومينيات إنزيميا لإعداد تعليق أحادي الخلية ، مما يؤدي إلى توسع LLECs مع عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C) ، واختيار الخلايا الإيجابية لمستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) من خلال فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). أدت هذه العملية في النهاية إلى إنشاء ثقافة أولية. تم تأكيد نقاء LLECs من خلال تلطيخ التألق المناعي وتحليل التدفق الخلوي ، مع مستوى نقاء يتجاوز 95٪. وقد أثبت هذا البروتوكول متعدد الخطوات قابلية التكرار والجدوى ، مما سيسهل إلى حد كبير استكشاف الوظيفة الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.

Introduction

تشكل الخلايا البطانية اللمفاوية المكتشفة حديثا (LLECs) شبكة من الخلايا الفردية داخل leptomeninges ، وتظهر نمط توزيع متميز عند مقارنتها بالخلايا البطانية اللمفاوية المحيطية 1,2. لا تزال الوظائف الخلوية والآثار السريرية المرتبطة ب LLECs منطقة مجهولة إلى حد كبير. من أجل تمهيد الطريق للبحث الوظيفي على LLECs ، من الضروري إنشاء نموذج في المختبر لدراستهم. لذلك ، ابتكرت هذه الدراسة بروتوكولا شاملا للعزل والثقافة الأولية ل LLECs.

الفئران هي النموذج الحيواني المفضل بسبب ملاءمتها للتلاعب الجيني في أبحاث الأمراض. نجحت الدراسات السابقة في عزل الخلايا البطانية اللمفاوية من أنسجة الفئران المختلفة ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية3 ، والأنسجة المساريقية4 ، والأنسجة الجلدية5 ، وجمع اللمفاويات6 ، وأنسجة الرئة7. اعتمدت إجراءات العزل هذه بشكل أساسي على تقنيات مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) وفرز قياس التدفق الخلوي8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، أدت الجهود البحثية إلى إنشاء خطوط الخلايا العنكبوتية للفئران وخطوط الخلايا الشعرية اللمفاوية للفئران11,12. على الرغم من وجود تقنيات الاستزراع الخارجي ل leptomeninges13 ، إلا أن هناك حاجة ملحة لبروتوكول موحد لعزل وزراعة LLECs. وبالتالي ، نجحت هذه الدراسة في حصاد وزراعة LLECs من خلال فصل leptomeninges بدقة تحت إشراف المجهر وتعزيز توسع LLECs من خلال استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C). العلامة المميزة للخلايا البطانية اللمفاوية هي مستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) 14. يقوم هذا البروتوكول متعدد الخطوات بعزل LLECs الإيجابية LYVE-1 بشكل انتقائي باستخدام MACS ويتحقق لاحقا من نقائها من خلال التحليل الخلوي للتدفق وتلطيخ الفلورسنت المناعي.

يمكن تلخيص الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول متعدد الخطوات على النحو التالي: طلاء القارورة ، تفكك leptomeninges ، الهضم الأنزيمي لل leptomeninges ، توسع الخلايا ، اختيار الخلايا المغناطيسية ، والثقافة اللاحقة ل LLECs. أخيرا ، يتم تأكيد نقاء LLECs المعزولة من خلال تحليل التدفق الخلوي وتلطيخ الفلورسنت المناعي. الهدف الشامل من هذه الدراسة هو تقديم بروتوكول قابل للتكرار ومتعدد الخطوات لعزل LLECs من leptomeninges الفئران وثقافتها اللاحقة في المختبر . هذا البروتوكول مهيأ لتسهيل التحقيقات بشكل كبير في الوظائف الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.

Protocol

حصل هذا البحث على موافقة من لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). التزمت جميع التجارب بالمبادئ التوجيهية المعمول بها لرعاية. تم حصاد الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) من ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن ما بين 20-25 جم. تم شراء هذه الفئران من جامعة كونمينغ الطبية في كونمينغ ، الصين. تم إجراء الإجراء التجريبي بأكمله في ظل ظروف معقمة صارمة. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد الكواشف والأدوات

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات التي تتضمن حلولا داخل خزانة مخاطر بيولوجية من الفئة الثانية.

  1. قم بإعداد محلول الغسيل عن طريق خلط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (P / S) (انظر جدول المواد). حافظ على هذا المخزن المؤقت باردا عند 4 درجات مئوية. من الضروري تحضيره طازجا في يوم الاستخدام وإزالة الغاز من المخزن المؤقت.
  2. تحضير الإنزيمات الهاضمة عن طريق الجمع بين 10 مل من PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) مع 2 مل من 0.25٪ تربسين ، 1 مل من 20 مجم / مل غراء ، و 200 ميكرولتر من 1 مجم / مل كولاجيناز I (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من استخدام حصص الأحجام المناسبة لمنع تكرار دورات التجميد والذوبان. قم بتخزين هذه القسوم في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد وسط الاستزراع من خلال استخدام مجموعة وسائط نمو الخلايا البطانية المتاحة تجاريا ، والتي تشمل VEGF-C (100 نانوغرام / مل) و 1٪ P / S (انظر جدول المواد).
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت للإيقاف عن طريق استكمال وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بنسبة 10٪ FBS لإيقاف عملية الهضم.
  5. تحضير الأدوات الجراحية المعقمة: يجب أن تشتمل هذه الأدوات على مقص وملاقط مسننة وملاقط دقيقة.

2. طلاء قارورة

  1. قم بتغطية دورق T25 بمحلول فيبرونيكتين 100 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بإزالة محلول الطلاء باستخدام ماصة.
  2. اغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم قم بشفط PBS ، واترك قارورة T25 تجف في الهواء.

3. تفكك Leptomeninges

ملاحظة: استخدم دائما المخازن المؤقتة والمحاليل المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية.

  1. تخدير الفئران باستنشاق زائد من 4٪ إيزوفلوران ثم التضحية بها عن طريق قطع الرأس السريع باستخدام مقص تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. شق الجلد بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة وتمتد نحو المنطقة الأمامية.
  3. قم بإزالة الجمجمة بدقة ، وارفعها برفق بالمقص لتجنب إتلاف اللبتونينج ، مما يضمن الحصول على الدماغ بالكامل ، بما في ذلك leptomeninges.
  4. اغمر الدماغ كله في مخزن مؤقت للغسيل واغسله برفق لإزالة الدم السطحي.
  5. نقل الدماغ إلى طبق بتري معقم دون تقطيع ، واستخراج leptomeninges من سطح الدماغ باستخدام ملاقط دقيقة تحت المجهر.
  6. قطع الأنسجة leptomeninges إلى شظايا باستخدام مقص دقيق معقمة.

4. Leptomeninges الهضم الأنزيمي

  1. أضف 10 مل من مزيج الإنزيم (الخطوة 1.2) إلى الشظايا واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. حرك برفق لضمان فصل الشظايا عن قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت للإيقاف (الخطوة 1.4) لوقف عملية الهضم.
  2. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
  3. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد ، وقم بتمرير الخليط من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب معقم سعة 50 مل لتصفية أي كتل.

5. توسيع الخلية

  1. لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم 2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين (الخطوة2) مع5 مل من وسط الاستزراع.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط للتخلص من الخلايا غير المرفقة.
  3. الحفاظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يومين. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.

6. اختيار الخلية المغناطيسية

ملاحظة: اعمل بسرعة ، وحافظ على برودة الخلية ، واستخدم المحاليل المبردة مسبقا لمنع وضع علامات غير محددة على الخلايا.

  1. تحضير الأدوات والكواشف: قم بتوصيل فاصل مغناطيسي بحامل فاصل مغناطيسي (انظر جدول المواد). قم بتوصيل عمود التحديد بالفاصل المغناطيسي ، وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق عمود التحديد. ضع أنبوبا سعة 50 مل أسفل عمود التحديد لجمع التدفق.
  2. الهضم الأنزيمي: بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، قم بشفط الوسط وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة المخزن المؤقت للتوقف. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.
  3. حضانة الأجسام المضادة: أعد تعليق 1 × 107 خلايا إجمالية في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1 (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
    1. أدر الخلايا على 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. شطف الخلايا عن طريق إدخال 1 مل من PBS والطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. تماما إزالة طاف.
  4. وضع العلامات على الميكروبيدات: أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
    1. أدر الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وصب المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتطهير الخلايا باستخدام 1 مل من PBS من خلال الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية تماما.
  5. الاستبعاد السلبي المغناطيسي: أعد تعليق الخلايا في 4 مل من PBS. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر للتخلص من الكتل. قم بإعداد عمود التحديد (انظر جدول المواد) عن طريق شطفه ب 3 مل من PBS ، ثم قم بتطبيق تعليق الخلية في عمود التحديد.
    1. قم بإجراء خطوات الغسيل باستخدام 3 مل من PBS واجمع الخلايا السالبة LYVE-1 في أنبوب سعة 50 مل يتم وضعه أسفل عمود التحديد للسماح لها بالمرور.
  6. الاختيار الإيجابي المغناطيسي: ماصة 6 مل من PBS في عمود التحديد. اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية على الفور عن طريق دفع المكبس بقوة في عمود التحديد للحصول على LLECs إيجابية LYVE-1.
    ملاحظة: انتظر دائما حتى يصبح خزان عمود التحديد فارغا قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.

7. ثقافة الشركات ذات المسؤولية المحدودة

  1. قم بطرد مركزي LLECs الإيجابية LYVE-1 عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  2. لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين مع5 مل من وسط الثقافة.
  3. حافظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، افصل الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين وقم بمرور الخلية. استخدم الخلايا للتجارب اللاحقة بعد 2-3 ممرات.

8. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باتباع الإجراء15 الموضح سابقا.

  1. أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أضف المخزن المؤقت لوقف عملية الهضم.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ونضح تماما طاف طفا. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS.
  3. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  4. أعد تعليق الخلايا بكمية مناسبة من المخزن المؤقت PBS للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي وبرنامج FlowJo (انظر جدول المواد).

9. تلطيخ المناعي

ملاحظة: تم إجراء تلطيخ المناعي باتباع الإجراء الموصوف سابقا16.

  1. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من PFA واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  2. ضع المخزن المؤقت للكتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للكتلة من أغطية الغطاء.
  3. أضف الجسم المضاد LYVE-1 في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانه في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
  4. أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانها في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
  5. كاونتر ستاين مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI). الخلايا جاهزة الآن للفحص المجهري المناعي.

النتائج

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الخطوات قابل للتكرار لحصاد الخلايا البطانية اللمفاوية (LLECs) من الفئران وبالتالي إنشاء ثقافتها الأولية في المختبر. تتضمن الخطوات الرئيسية تحضير القارورة وطلاء الفبرونيكتين ، وتفكك الليبتومينينج ، والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال الهضم الأنزيم?...

Discussion

لم يتم الإبلاغ من قبل عن البروتوكول الحالي لحصاد واستزراع LLECs في المختبر . تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الإجراءات قابل للتكرار لحصاد وزراعة LLECs من leptomeninges الفئران.

في حين أن هذا البروتوكول متعدد الإجراءات قابل للتكرار ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات الرئيسية. على...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226 ، 81760223) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة يونان (202001AS070045 ، 202301AY070001-011) ، ومؤسسة البحث العلمي التابعة لوزارة التعليم بمقاطعة يوننان (2023Y0784).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Block bufferBeyotimeP0102Store aliquots at –4 °C
Collagenase ISolarbioC8140Store aliquots at –20 °C
DAPIBeyotimeP0131Store aliquots at –20 °C
DMEMSolarbio11995Store aliquots at –4 °C
D-PBSSolarbioD1041Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet KitLonzaC-3202Store aliquots at –4 °C
FBSSolarbioS9010Store aliquots at –20 °C
FibronectinSolarbioF8180 Store aliquots at –20 °C
FlowJo SoftwareBD BiosciencesV10.8.1
LYVE-1 antibodyeBioscience12-0443-82Store aliquots at –4 °C
Magnetic separatorMiltenyi130-042-302Sterile before use
Magnetic separator standMiltenyi130-042-303Sterile before use
MicrobeadsMiltenyi130-048-801Store aliquots at –4 °C
P/SSolarbioP1400Store aliquots at –20 °C
PapainSolarbioG8430-25gStore aliquots at –20 °C
PBSSolarbioD1040Store aliquots at –4 °C
PDPN antibodySantasc-53533Store aliquots at –4 °C
PFASolarbioP1110Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibodySantasc-81983Store aliquots at –4 °C
Selection column Miltenyi130-042-401Sterile before use
TrypsinGibco25200072Store aliquots at –20 °C
VEGF-C Abcamab51947Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibodySantasc-514825Store aliquots at –4 °C

References

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
  3. Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
  4. Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
  5. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  6. Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
  7. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  8. Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
  9. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  10. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
  11. Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
  12. Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
  13. Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
  14. Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
  15. Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
  16. Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
  17. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
  18. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
  19. Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
  20. Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
  21. DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
  22. Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
  23. Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
  24. Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Leptomeningeal LLECs Leptomeninges C VEGF C 1 LYVE 1 MACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved