الحصاد والزراعة الأولية للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal

Summary

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) ، وهي نوع من الخلايا داخل الجمجمة تم تحديده مؤخرا ، لها وظائف غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قابلا للتكرار لحصاد LLECs من الفئران وإنشاء مزارع أولية في المختبر . تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين الباحثين من الخوض في الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة ل LLECs.

Abstract

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) هي مجموعة خلوية داخل الجمجمة تم اكتشافها مؤخرا مع توزيع فريد متميز بوضوح عن الخلايا البطانية اللمفاوية الطرفية. وظيفتها الخلوية وآثارها السريرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توافر إمدادات من LLECs أمر ضروري لإجراء البحوث الوظيفية في المختبر. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول قائم لحصاد وزراعة LLECs في المختبر.

نجحت هذه الدراسة في حصاد LLECs باستخدام بروتوكول متعدد الخطوات ، والذي تضمن طلاء القارورة بالفبرونيكتين ، وتشريح الليبتومينيات بمساعدة المجهر ، وهضم الليبتومينيات إنزيميا لإعداد تعليق أحادي الخلية ، مما يؤدي إلى توسع LLECs مع عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C) ، واختيار الخلايا الإيجابية لمستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) من خلال فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). أدت هذه العملية في النهاية إلى إنشاء ثقافة أولية. تم تأكيد نقاء LLECs من خلال تلطيخ التألق المناعي وتحليل التدفق الخلوي ، مع مستوى نقاء يتجاوز 95٪. وقد أثبت هذا البروتوكول متعدد الخطوات قابلية التكرار والجدوى ، مما سيسهل إلى حد كبير استكشاف الوظيفة الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.

Introduction

تشكل الخلايا البطانية اللمفاوية المكتشفة حديثا (LLECs) شبكة من الخلايا الفردية داخل leptomeninges ، وتظهر نمط توزيع متميز عند مقارنتها بالخلايا البطانية اللمفاوية المحيطية ^1,2. لا تزال الوظائف الخلوية والآثار السريرية المرتبطة ب LLECs منطقة مجهولة إلى حد كبير. من أجل تمهيد الطريق للبحث الوظيفي على LLECs ، من الضروري إنشاء نموذج في المختبر لدراستهم. لذلك ، ابتكرت هذه الدراسة بروتوكولا شاملا للعزل والثقافة الأولية ل LLECs.

الفئران هي النموذج الحيواني المفضل بسبب ملاءمتها للتلاعب الجيني في أبحاث الأمراض. نجحت الدراسات السابقة في عزل الخلايا البطانية اللمف....

Protocol

حصل هذا البحث على موافقة من لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). التزمت جميع التجارب بالمبادئ التوجيهية المعمول بها لرعاية. تم حصاد الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) من ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن ما بين 20-25 جم. تم شراء هذه الفئران من جامعة كونمينغ الطبية في كونمينغ ، الصين. تم إجراء الإجراء التجريبي بأكمله في ظل ظروف معقمة صارمة. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد الكواشف والأدوات

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات التي تتضمن حلولا داخل خزانة مخاطر بيولوجية من الفئة ا....

النتائج

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الخطوات قابل للتكرار لحصاد الخلايا البطانية اللمفاوية (LLECs) من الفئران وبالتالي إنشاء ثقافتها الأولية في المختبر. تتضمن الخطوات الرئيسية تحضير القارورة وطلاء الفبرونيكتين ، وتفكك الليبتومينينج ، والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال الهضم الأنزيم?.......

Discussion

لم يتم الإبلاغ من قبل عن البروتوكول الحالي لحصاد واستزراع LLECs في المختبر . تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الإجراءات قابل للتكرار لحصاد وزراعة LLECs من leptomeninges الفئران.

في حين أن هذا البروتوكول متعدد الإجراءات قابل للتكرار ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات الرئيسية. على.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C