JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (LLECs), недавно идентифицированный тип внутричерепных клеток, имеют плохо изученные функции. В этом исследовании представлен воспроизводимый протокол получения LLEC у мышей и создания первичных культур in vitro . Этот протокол предназначен для того, чтобы позволить исследователям углубиться в клеточные функции и потенциальные клинические последствия LLEC.

Аннотация

Лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (ЛЛЕК) представляют собой недавно обнаруженную внутричерепную клеточную популяцию с уникальным распределением, четко отличающимся от периферических лимфатических эндотелиальных клеток. Их клеточная функция и клинические последствия остаются в значительной степени неизвестными. Следовательно, наличие запаса LLEC имеет важное значение для проведения функциональных исследований in vitro. Тем не менее, в настоящее время не существует протокола для сбора и культивирования LLEC in vitro.

В этом исследовании был успешно собран LLEC с использованием многоступенчатого протокола, который включал покрытие колбы фибронектином, рассечение лептоменингов с помощью микроскопа, ферментативное расщепление лептоменингов для получения одноклеточной суспензии, индуцирование экспансии LLEC с фактором роста эндотелия сосудов-С (VEGF-C) и отбор положительных клеток гиалуронового рецептора-1 лимфатических сосудов (LYVE-1) с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот процесс в конечном итоге привел к формированию первичной культуры. Чистота ЛЛЭК подтверждена методом иммунофлуоресцентного окрашивания и проточного цитометрического анализа, при этом уровень чистоты превысил 95%. Этот многоступенчатый протокол продемонстрировал воспроизводимость и осуществимость, что значительно облегчит изучение клеточной функции и клинических последствий LLEC.

Введение

Недавно обнаруженные лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (ЛЛЕК) образуют сетку из отдельных клеток в лептоменингах, демонстрируя отчетливую картину распределения по сравнению с периферическими лимфатическими эндотелиальными клетками 1,2. Клеточные функции и клинические последствия, связанные с LLEC, остаются в значительной степени неизведанной территорией. Для того, чтобы проложить путь для функциональных исследований LLEC, необходимо создать модель in vitro для их изучения. Таким образом, в этом исследовании был разработан комплексный протокол для изоляции и первичной культуры LLEC.

Мыши являются предпочтительной животной моделью из-за их пригодности для генетических манипуляций при исследовании заболеваний. В предыдущих исследованиях были успешно выделены лимфатические эндотелиальные клетки из различных тканей мышей, включая лимфатические узлы3, брыжеечную ткань4, дермальную ткань5, собирающие лимфатические элементы6 и легочную ткань7. Эти процедуры выделения в основном основывались на таких методах, как магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) и сортировка методом проточной цитометрии 8,9,10. Кроме того, исследовательские усилия привели к созданию линий арахноидальных клеток крыс и лимфатических капиллярных клеточных линийкрыс 11,12. Несмотря на существование методов культивирования эксплантов для лептоменингов13, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе для выделения и культивирования ЛЛЭК. Следовательно, в этом исследовании был успешно собран и культивирован LLEC путем тщательной диссоциации лептоменингов под контролем микроскопа и стимулирования экспансии LLEC с помощью фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-C). Отличительным маркером лимфатических эндотелиальных клеток является гиалуроновый рецептор-1 лимфатического сосуда (LYVE-1)14. Этот многоступенчатый протокол селективно изолирует LYVE-1-положительные LLEC с помощью MACS и впоследствии проверяет их чистоту с помощью проточного цитометрического анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Основные этапы этого многоэтапного протокола можно резюмировать следующим образом: покрытие колбы, диссоциация лептоменингов, ферментативное расщепление лептоменингов, клеточная экспансия, магнитный отбор клеток и последующее культивирование LLEC. Наконец, чистота выделенных ЛЛЕК подтверждается с помощью проточного цитометрического анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания. Основная цель данного исследования состоит в том, чтобы представить воспроизводимый многоступенчатый протокол выделения LLEC из мышиных лептоменингов и их последующего культивирования in vitro . Этот протокол призван значительно облегчить исследования клеточных функций и клинических последствий LLECs.

протокол

Это исследование получило одобрение Комитета по этике экспериментов на животных Куньминского медицинского университета (kmmu20220945). Все эксперименты проводились в соответствии с установленными рекомендациями по уходу за животными. Лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (LLEC) были получены от самцов мышей C57Bl/6J в возрасте 6-8 недель и весом от 20 до 25 г. Эти мыши были закуплены в Куньминском медицинском университете в Куньмине, Китай. Весь эксперимент проводился в строгих стерильных условиях. Все этапы центрифугирования выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка реактивов и инструментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, связанные с растворами, должны выполняться в шкафу биологической опасности класса II.

  1. Приготовьте буфер для промывки, смешав фосфатно-солевой буфер (PBS) с кальцием и магнием, 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (P/S) (см. таблицу материалов). Храните этот буфер в холоде при температуре 4 °C. Важно приготовить его свежим в день использования и дегазировать буфер.
  2. Приготовьте пищеварительные ферменты, соединив 10 мл PBS (без кальция и магния) с 2 мл 0,25% трипсина, 1 мл 20 мг/мл папаина и 200 мкл 1 мг/мл коллагеназы I (см. таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте использование аликвот соответствующих объемов, чтобы предотвратить повторные циклы замораживания-оттаивания. Храните эти аликвоты при температуре -20 °C.
  3. Подготовьте питательную среду, используя коммерчески доступный набор среды для выращивания эндотелиальных клеток, который включает VEGF-C (100 нг/мл) и 1% P/S (см. таблицу материалов).
  4. Приготовьте стоп-буфер, добавив модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco с 10% FBS, чтобы остановить процесс пищеварения.
  5. Подготовьте стерильные хирургические инструменты: эти инструменты должны включать ножницы, пинцет с зазубренным концом и пинцет с тонким концом.

2. Покрытие колбы

  1. Покройте колбу T25 раствором фибронектина в концентрации 100 мкг/мл (см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Перед использованием удалите раствор покрытия с помощью пипетки.
  2. Трижды промойте колбу PBS, затем аспирируйте PBS и дайте колбе T25 высохнуть на воздухе.

3. Диссоциация лептоменингов

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте предварительно охлажденные буферы и растворы при температуре 4 °C.

  1. Обезболивайте мышей избыточной ингаляцией 4% изофлурана, а затем приносите их в жертву путем быстрого обезглавливания ножницами, которые были предварительно очищены 70% этанолом.
  2. Осторожно надрежьте кожу по средней линии, начиная от отверстия в задней части черепа и распространяясь к лобной области.
  3. Осторожно извлеките череп, осторожно приподняв его ножницами, чтобы не повредить лептоменинги, обеспечив получение всего мозга, включая лептоменинги.
  4. Погрузите весь мозг в буфер для промывки и осторожно промойте его, чтобы удалить поверхностную кровь.
  5. Перенесите мозг в стерильную чашку Петри, не измельчая, и извлеките лептоменинги с поверхности мозга с помощью тонкого пинцета под микроскопом.
  6. Разрежьте лептоменинговую ткань на фрагменты с помощью стерильных микроножниц.

4. Ферментативное пищеварение лептоменингов

  1. Добавьте к фрагментам 10 мл ферментной смеси (шаг 1,2) и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. Осторожно перемешайте, чтобы убедиться, что фрагменты отделились от дна трубки. После этого добавьте 10 мл буфера (шаг 1.4), чтобы остановить пищеварение.
  2. Центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  3. Добавьте 10 мл холодного PBS и пропустите смесь через ситечко 70 мкм в стерильную пробирку объемом 50 мл, чтобы отфильтровать любые комки.

5. Расширение клеток

  1. Планшет 1 x 10 5 клеток насм2 в покрытую фибронектином колбу T25 (шаг 2) с5 мл питательной среды.
  2. Инкубируют клетки при 37 °C с 5%СО2 в течение 24 ч. После этого удалите среду, чтобы удалить неприкрепленные клетки.
  3. Поддерживайте культуру, заменяя 50% среды каждые два дня. Повторите этот процесс два-три раза.

6. Выбор магнитных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, поддерживайте холод в клетках и используйте предварительно охлажденные растворы для предотвращения неспецифического мечения клеток.

  1. Подготовка инструментов и реагентов: прикрепить магнитный сепаратор к стойке магнитного сепаратора (см. Таблицу материалов). Подсоедините селекционную колонку к магнитному сепаратору и поместите сетчатый фильтр 70 мкм поверх селекционной колонки. Поместите пробирку объемом 50 мл под колонку отбора для сбора потока.
  2. Ферментативное пищеварение: как только клетки достигнут 80% слияния, аспирируют среду и промывают клетки PBS. Добавьте 0,25% трипсина, чтобы отделить адгезивные клетки, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин. Остановите пищеварение, добавив буфер остановки. Центрифугируют клетки при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и удаляют надосадочную жидкость.
  3. Инкубация антител: ресуспендировать 1 x 107 клеток в 100 мкл PBS и добавить 10 мкл антитела LYVE-1 (см. таблицу материалов). Тщательно перемешать и выдержать 30 мин в темноте при температуре 4 °С.
    1. Вращайте клетки при 300 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Промыть клетки, введя 1 мл PBS и центрифугируя при 300 x g в течение 5 мин. Полностью удалить надосадочную жидкость.
  4. Маркировка микрогранулами: ресуспендировать клетки в 100 мкл PBS и добавить 20 мкл микрогранул (см. таблицу материалов). Хорошо перемешать и выдержать 30 мин в темноте при температуре 4 °C.
    1. Отжим клетки при 300 x g в течение 5 мин и сцедите надосадочную жидкость. Затем очистите клетки 1 мл PBS путем центрифугирования при 300 x g в течение 5 мин. Наконец, полностью удалите надосадочную жидкость.
  5. Магнитно-отрицательное исключение: ресуспендировать клетки в 4 мл PBS. Пропустите клетки через ситечко для клеток 70 мкм, чтобы удалить скопления. Подготовьте селекционную колонку (см. Таблицу материалов), промыв ее 3 мл PBS, затем нанесите клеточную суспензию в селекционную колонку.
    1. Выполните этапы промывки 3 мл PBS и соберите LYVE-1-отрицательные клетки в пробирку объемом 50 мл, расположенную под колонкой отбора, чтобы они могли пройти.
  6. Магнитный положительный отбор: пипетка 6 мл PBS в колонку отбора. Мгновенно промывают магнитно-меченые ячейки, с усилием вдавливая поршень в селекционную колонку, чтобы получить LYVE-1-положительные LLEC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда ждите, пока резервуар столбца выбора не опустеет, прежде чем переходить к следующему шагу.

7. Культура LLEC

  1. Центрифугируют LYVE-1-положительные LLEC при 300 x g в течение 5 мин, а затем осторожно удаляют надосадочную жидкость.
  2. Планшет 1 x 10 5 клеток насм2 в покрытую фибронектином колбу T25 с5 мл питательной среды.
  3. Поддерживайте культуру, заменяя 50% среды через день. Когда клетки достигнут 80% слияния, отделите клетки 0,25% трипсином и выполните клеточный пассаж. Используйте клетки для последующих экспериментов после 2-3 проходов.

8. Анализ проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометрический анализ проводили по ранее описанной процедуре15.

  1. Добавьте 0,25% трипсина, чтобы отделить адгезивные клетки, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин. Затем добавьте буфер остановки, чтобы остановить пищеварение.
  2. Центрифугируют клетки при 300 х г в течение 5 мин и полностью аспирируют надосадочную жидкость. Ресуспендировать 1 x 106 ячеек в 100 мкл PBS.
  3. Добавьте 1 мкл антитела LYVE-1. Тщательно перемешать и выдержать 10 мин в темноте при комнатной температуре.
  4. Ресуспендируйте клетки в соответствующем количестве PBS-буфера для анализа с помощью проточной цитометрии и программного обеспечения FlowJo (см. таблицу материалов).

9. Иммунофлуоресцентное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили в соответствии с процедурой, описанной ранее16.

  1. Промойте клетки ПБС три раза. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (PFA) в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте PFA и промойте клетки PBS три раза.
  2. Нанесите блочный буфер на 1 ч при комнатной температуре. Извлеките буфер блоков из покровных листов.
  3. Добавьте антитело LYVE-1 в буфер для окрашивания к клеткам и инкубируйте в темноте. Трижды промойте клетки ПБС.
  4. Добавьте соответствующее вторичное антитело (см. Таблицу материалов) в буфер для окрашивания к клеткам и инкубируйте в темноте. Трижды промойте клетки ПБС.
  5. Контрокраска 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Теперь клетки готовы к иммунофлуоресцентной микроскопии.

Результаты

В этом исследовании представлен воспроизводимый многоступенчатый протокол забора лимфатических эндотелиальных клеток (LLEC) у мышей и последующего создания их первичной культуры in vitro. Основные этапы включают подготовку колбы и покрытие фибронектином, диссоциацию лептоменингов, ?...

Обсуждение

О существующем протоколе сбора и культивирования LLEC in vitro ранее не сообщалось. В этом исследовании представлен воспроизводимый, многопроцедурный протокол сбора и культивирования LLEC из лептоменингов мышей.

Несмотря на то, что этот многопроцедурный протокол воспрои?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, который они должны раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81960226, 81760223), Фонда естественных наук провинции Юньнань (202001AS070045, 202301AY070001-011) и Научно-исследовательского фонда Департамента образования провинции Юньнань (2023Y0784).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Block bufferBeyotimeP0102Store aliquots at –4 °C
Collagenase ISolarbioC8140Store aliquots at –20 °C
DAPIBeyotimeP0131Store aliquots at –20 °C
DMEMSolarbio11995Store aliquots at –4 °C
D-PBSSolarbioD1041Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet KitLonzaC-3202Store aliquots at –4 °C
FBSSolarbioS9010Store aliquots at –20 °C
FibronectinSolarbioF8180 Store aliquots at –20 °C
FlowJo SoftwareBD BiosciencesV10.8.1
LYVE-1 antibodyeBioscience12-0443-82Store aliquots at –4 °C
Magnetic separatorMiltenyi130-042-302Sterile before use
Magnetic separator standMiltenyi130-042-303Sterile before use
MicrobeadsMiltenyi130-048-801Store aliquots at –4 °C
P/SSolarbioP1400Store aliquots at –20 °C
PapainSolarbioG8430-25gStore aliquots at –20 °C
PBSSolarbioD1040Store aliquots at –4 °C
PDPN antibodySantasc-53533Store aliquots at –4 °C
PFASolarbioP1110Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibodySantasc-81983Store aliquots at –4 °C
Selection column Miltenyi130-042-401Sterile before use
TrypsinGibco25200072Store aliquots at –20 °C
VEGF-C Abcamab51947Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibodySantasc-514825Store aliquots at –4 °C

Ссылки

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
  3. Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
  4. Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
  5. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  6. Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
  7. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  8. Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
  9. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  10. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
  11. Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
  12. Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
  13. Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
  14. Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
  15. Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
  16. Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
  17. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
  18. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
  19. Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
  20. Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
  21. DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
  22. Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
  23. Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
  24. Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

LLECin vitroVEGF C1 LYVE 1MACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены