Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Riepilogo

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Abstract

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.

Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l'assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l'induzione dell'espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l'esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.

Introduzione

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all'interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche ^1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l'isolamento e la coltura primaria delle LLEC.

I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi³, il tessuto mesenterico⁴, il tessuto dermico⁵, i linfatici di raccolta⁶ e il tessuto polmonare⁷. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso ^8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto^11,12. Nonostante l'esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi¹³, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l'isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l'espansione delle LLEC attraverso l'uso del fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)¹⁴. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.

Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L'obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l'isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.

Protocollo

Questa ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L'intera procedura sperimentale è stata condotta in condizioni di sterilità rigorosa. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato.

1. Preparazione dei reagenti e degli strumenti

NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono le soluzioni devono essere eseguite all'interno di un armadio a rischio biologico di classe II.

1. Preparare il tampone di lavaggio mescolando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con calcio e magnesio, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali). Conservare questo tampone al freddo a 4 °C. È fondamentale prepararlo fresco il giorno dell'utilizzo e degassare il tampone.
2. Preparare gli enzimi digestivi combinando 10 mL di PBS (senza calcio e magnesio) con 2 mL di tripsina allo 0,25%, 1 mL di papaina 20 mg/mL e 200 μL di collagenasi I da 1 mg/mL (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Assicurarsi dell'uso di aliquote di volumi appropriati per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Conservare queste aliquote a -20 °C.
3. Preparare il terreno di coltura utilizzando il kit di terreno di crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio, che include VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (vedere la tabella dei materiali).
4. Preparare il tampone di arresto integrando il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di FBS per arrestare il processo di digestione.
5. Prepara strumenti chirurgici sterili: questi strumenti dovrebbero includere forbici, pinzette a punta seghettata e pinzette a punta fine.

2. Rivestimento del pallone

1. Rivestire il matraccio T25 con una soluzione di fibronectina 100 μg/mL (vedere Tabella dei materiali) e incubare per una notte a 37 °C. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta.
2. Lavare il pallone tre volte con PBS, successivamente aspirare il PBS e lasciare asciugare il pallone T25 all'aria.

3. Dissociazione delle leptomeningi

NOTA: Utilizzare sempre tamponi e soluzioni preraffreddati a 4 °C.

1. Anestetizzare i topi con un'inalazione eccessiva di isoflurano al 4% e poi sacrificarli mediante rapida decapitazione utilizzando forbici precedentemente pulite con etanolo al 70%.
2. Incidere con cura la pelle lungo la linea mediana, partendo dall'apertura nella parte posteriore del cranio ed estendendosi verso la zona frontale.
3. Rimuovere delicatamente il cranio, sollevandolo delicatamente con le forbici per evitare di danneggiare le leptomeningi, assicurandosi di ottenere l'intero cervello, comprese le leptomeningi.
4. Immergere l'intero cervello in un tampone di lavaggio e sciacquarlo delicatamente per rimuovere il sangue superficiale.
5. Trasferisci il cervello in una capsula di Petri sterile senza tritare ed estrai le leptomeningi dalla superficie del cervello usando una pinzetta a punta fine al microscopio.
6. Tagliare il tessuto delle leptomeningi in frammenti utilizzando microforbici sterili.

4. Digestione enzimatica delle leptomeningi

1. Aggiungere 10 mL della miscela enzimatica (fase 1.2) ai frammenti e incubare a 37 °C per 15 min. Agitare delicatamente per assicurarsi che i frammenti si stacchino dal fondo del tubo. Successivamente, aggiungere 10 ml di tampone di arresto (passaggio 1.4) per arrestare la digestione.
2. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.
3. Aggiungere 10 mL di PBS freddo e passare la miscela attraverso un colino da 70 μm in una provetta sterile da 50 mL per filtrare eventuali grumi.

5. Espansione cellulare

1. Piastra 1 x 10 5 cellule per cm 2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina (fase²) con⁵ mL di terreno di coltura.
2. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore. Successivamente, rimuovere il terreno per eliminare le cellule non attaccate.
3. Sostenere la cultura sostituendo il 50% del terreno ogni due giorni. Ripeti questo processo due o tre volte.

6. Selezione della cella magnetica

NOTA: Lavorare rapidamente, mantenere la freddezza delle celle e utilizzare soluzioni pre-raffreddate per prevenire l'etichettatura non specifica delle cellule.

1. Preparazione degli strumenti e dei reagenti: collegare un separatore magnetico a un supporto per separatore magnetico (vedere la tabella dei materiali). Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra la colonna di selezione. Posizionare una provetta da 50 ml sotto la colonna di selezione per raccogliere il flusso.
2. Digestione enzimatica: una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il terreno e risciacquare le cellule con PBS. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Arrestare la digestione aggiungendo il tampone di arresto. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
3. Incubazione degli anticorpi: risospendere 1 x 10⁷ cellule totali in 100 μL di PBS e aggiungere 10 μL di anticorpo LYVE-1 (vedere la tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
   1. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sciacquare le cellule introducendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.
4. Marcatura delle microsfere: risospendere le cellule in 100 μL di PBS e aggiungere 20 μL di Microsfere (vedi Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
   1. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti e travasare il surnatante. Successivamente, detergere le cellule con 1 mL di PBS attraverso centrifugazione a 300 x g per 5 min. Infine, rimuovere completamente il surnatante.
5. Esclusione magnetica negativa: risospendere le cellule in 4 mL di PBS. Passare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 μm per eliminare i grumi. Preparare la colonna di selezione (vedere Tabella dei materiali) sciacquandola con 3 mL di PBS, quindi applicare la sospensione cellulare nella colonna di selezione.
   1. Eseguire le fasi di lavaggio con 3 mL di PBS e raccogliere le cellule LYVE-1-negative in una provetta da 50 mL posizionata sotto la colonna di selezione per consentirne il passaggio.
6. Selezione magnetica positiva: pipettare 6 mL di PBS nella colonna di selezione. Svuotare istantaneamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna di selezione per ottenere LLEC positivi a LYVE-1.
   NOTA: Attendere sempre che il serbatoio della colonna di selezione sia vuoto prima di procedere al passaggio successivo.

7. Cultura dei LLEC

1. Centrifugare gli LLEC LYVE-1-positivi a 300 x g per 5 minuti, quindi rimuovere con cautela il surnatante.
2. Inserire 1 x 10 5 cellule per cm² in un matraccio T25 rivestito di fibronectina con⁵ mL di terreno di coltura.
3. Mantieni la cultura sostituendo il 50% del mezzo a giorni alterni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina ed eseguire il passaggio cellulare. Utilizzare le cellule per esperimenti successivi dopo 2-3 passaggi.

8. Analisi citofluorimetrica

NOTA: L'analisi citofluorimetrica a flusso è stata condotta seguendo la procedura precedentemente descritta¹⁵.

1. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Quindi, aggiungi il tampone di arresto per arrestare la digestione.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e aspirare completamente il surnatante. Risospendere 1 x 10⁶ cellule in 100 μL di PBS.
3. Aggiungere 1 μL di anticorpo LYVE-1. Mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
4. Risospendere le cellule in una quantità appropriata di tampone PBS per l'analisi utilizzando la citometria a flusso e il software FlowJo (vedere Tabella dei materiali).

9. Colorazione immunofluorescente

NOTA: La colorazione immunofluorescente è stata condotta seguendo la procedura descritta in precedenza¹⁶.

1. Lavare le celle con PBS tre volte. Fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PFA e lavare le celle con PBS tre volte.
2. Applicare il tampone a blocchi per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco dai vetrini coprioggetti.
3. Aggiungere l'anticorpo LYVE-1 nel tampone di colorazione alle cellule e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.
4. Aggiungere alle cellule un anticorpo secondario appropriato (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.
5. Controcolorante con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Le cellule sono ora pronte per la microscopia a immunofluorescenza.

Risultati

Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l'ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l'induzione dell'espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selet...

Discussione

Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.

Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l'adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C