Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Résumé

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Résumé

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) sont une population cellulaire intracrânienne récemment découverte avec une distribution unique clairement distincte des cellules endothéliales lymphatiques périphériques. Leur fonction cellulaire et leurs implications cliniques restent largement inconnues. Par conséquent, la disponibilité d’un approvisionnement en LLEC est essentielle pour mener une recherche fonctionnelle in vitro. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole pour la récolte et la culture des LLEC in vitro.

Cette étude a permis de récolter avec succès les LLEC à l’aide d’un protocole en plusieurs étapes, qui comprenait l’enrobage de la fiole de fibronectine, la dissection des leptoméninges à l’aide d’un microscope, la digestion enzymatique des leptoméninges pour préparer une suspension unicellulaire, l’induction de l’expansion des LLEC avec le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C) et la sélection des cellules positives du récepteur hyaluronique des vaisseaux lymphatiques-1 (LYVE-1) par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Ce processus a finalement conduit à l’établissement d’une culture primaire. La pureté des LLEC a été confirmée par coloration par immunofluorescence et analyse par cytométrie en flux, avec un niveau de pureté supérieur à 95 %. Ce protocole en plusieurs étapes a démontré sa reproductibilité et sa faisabilité, ce qui facilitera grandement l’exploration de la fonction cellulaire et des implications cliniques des LLECs.

Introduction

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) nouvellement découvertes forment un maillage de cellules individuelles à l’intérieur des leptoméninges, présentant un modèle de distribution distinct par rapport aux cellules endothéliales lymphatiques périphériques ^1,2. Les fonctions cellulaires et les implications cliniques associées aux LLEC restent en grande partie un territoire inexploré. Afin d’ouvrir la voie à la recherche fonctionnelle sur les LLECs, il est impératif d’établir un modèle in vitro pour leur étude. Par conséquent, cette étude a mis au point un pr....

Protocole

Cette recherche a reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Toutes les expériences ont respecté les lignes directrices établies en matière de soins aux animaux. Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) ont été prélevées sur des souris mâles C57Bl/6J âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 25 g. Ces souris ont été achetées à l’Université de médecine de Kunming, en Chine. L’ensemble de la procédure expérimentale s’est déroulé dans des conditions stériles strictes. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contrair....

Discussion

Le protocole actuel pour la récolte et la culture in vitro des LLEC n’a pas encore été rapporté. Cette étude présente un protocole multiprocédural reproductible pour la récolte et la culture des LLEC à partir de leptoméninges de souris.

Bien que ce protocole multiprocédural soit reproductible, il y a plusieurs considérations clés. Par exemple, les flacons T25 enrobés de fibronectine favorisent l’adhésion des LLEC et leur fonction en éliminant les cellules non adhé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C