Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Résumé

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Résumé

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) sont une population cellulaire intracrânienne récemment découverte avec une distribution unique clairement distincte des cellules endothéliales lymphatiques périphériques. Leur fonction cellulaire et leurs implications cliniques restent largement inconnues. Par conséquent, la disponibilité d’un approvisionnement en LLEC est essentielle pour mener une recherche fonctionnelle in vitro. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole pour la récolte et la culture des LLEC in vitro.

Cette étude a permis de récolter avec succès les LLEC à l’aide d’un protocole en plusieurs étapes, qui comprenait l’enrobage de la fiole de fibronectine, la dissection des leptoméninges à l’aide d’un microscope, la digestion enzymatique des leptoméninges pour préparer une suspension unicellulaire, l’induction de l’expansion des LLEC avec le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C) et la sélection des cellules positives du récepteur hyaluronique des vaisseaux lymphatiques-1 (LYVE-1) par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Ce processus a finalement conduit à l’établissement d’une culture primaire. La pureté des LLEC a été confirmée par coloration par immunofluorescence et analyse par cytométrie en flux, avec un niveau de pureté supérieur à 95 %. Ce protocole en plusieurs étapes a démontré sa reproductibilité et sa faisabilité, ce qui facilitera grandement l’exploration de la fonction cellulaire et des implications cliniques des LLECs.

Introduction

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) nouvellement découvertes forment un maillage de cellules individuelles à l’intérieur des leptoméninges, présentant un modèle de distribution distinct par rapport aux cellules endothéliales lymphatiques périphériques ^1,2. Les fonctions cellulaires et les implications cliniques associées aux LLEC restent en grande partie un territoire inexploré. Afin d’ouvrir la voie à la recherche fonctionnelle sur les LLECs, il est impératif d’établir un modèle in vitro pour leur étude. Par conséquent, cette étude a mis au point un protocole complet pour l’isolement et la culture primaire des LLECs.

Les souris sont le modèle animal préféré en raison de leur aptitude à la manipulation génétique dans la recherche sur les maladies. Des études antérieures ont réussi à isoler des cellules endothéliales lymphatiques de divers tissus de souris, notamment les ganglions lymphatiques³, le tissu mésentérique⁴, le tissu dermique⁵, les lymphatiques collecteurs⁶ et le tissu pulmonaire⁷. Ces procédures d’isolement se sont principalement appuyées sur des techniques telles que le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) et le tri par cytométrie en flux ^8,9,10. De plus, les efforts de recherche ont conduit à l’établissement de lignées cellulaires arachnoïdiennes de rat et de lignées cellulaires capillaires lymphatiques de rat^11,12. Malgré l’existence de techniques de culture d’explants pour les leptoméninges¹³, il existe un besoin urgent d’un protocole normalisé pour l’isolement et la culture des LLECs. Par conséquent, cette étude a permis de récolter et de cultiver avec succès des LLEC en dissociant méticuleusement les leptoméninges sous la direction d’un microscope et en favorisant l’expansion des LLEC grâce à l’utilisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C). Le marqueur distinctif des cellules endothéliales lymphatiques est le récepteur hyaluronique du vaisseau lymphatique-1 (LYVE-1)¹⁴. Ce protocole en plusieurs étapes isole sélectivement les LLEC LYVE-1-positives à l’aide de MACS et vérifie ensuite leur pureté par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente.

Les principales étapes de ce protocole en plusieurs étapes peuvent être résumées comme suit : enrobage du flacon, dissociation des leptoméninges, digestion enzymatique des leptoméninges, expansion cellulaire, sélection magnétique des cellules et culture ultérieure des LLECs. Enfin, la pureté des LLEC isolées est confirmée par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente. L’objectif principal de cette étude est de présenter un protocole reproductible en plusieurs étapes pour l’isolement des LLEC à partir de leptoméninges de souris et leur culture in vitro ultérieure. Ce protocole est sur le point de faciliter grandement les recherches sur les fonctions cellulaires et les implications cliniques des LLECs.

Protocole

Cette recherche a reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Toutes les expériences ont respecté les lignes directrices établies en matière de soins aux animaux. Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) ont été prélevées sur des souris mâles C57Bl/6J âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 25 g. Ces souris ont été achetées à l’Université de médecine de Kunming, en Chine. L’ensemble de la procédure expérimentale s’est déroulé dans des conditions stériles strictes. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation des réactifs et des instruments

REMARQUE : Toutes les étapes impliquant des solutions doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire à risques biologiques de classe II.

1. Préparez le tampon de lavage en mélangeant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du calcium et du magnésium, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux). Conservez ce tampon au froid à 4 °C. Il est indispensable de le préparer frais le jour de l’utilisation et de dégazer le tampon.
2. Préparez les enzymes digestives en combinant 10 mL de PBS (sans calcium ni magnésium) avec 2 mL de trypsine à 0,25 %, 1 mL de papaïne à 20 mg/mL et 200 μL de collagénase I à 1 mg/mL (voir le tableau des matériaux).
   NOTA : S’assurer d’utiliser des aliquotes de volumes appropriés pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Conserver ces aliquotes à -20 °C.
3. Préparez le milieu de culture à l’aide de la trousse de milieu de croissance de cellules endothéliales disponible dans le commerce, qui comprend le VEGF-C (100 ng/mL) et 1 % de P/S (voir le tableau des matériaux).
4. Préparez le tampon d’arrêt en complétant le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pour arrêter le processus de digestion.
5. Préparez des instruments chirurgicaux stériles : ces instruments doivent inclure des ciseaux, une pince à épiler à pointe dentelée et une pince à épiler à pointe fine.

2. Revêtement de flacon

1. Enduire le flacon T25 d’une solution de fibronectine à 100 μg/mL (voir tableau des matériaux) et incuber toute la nuit à 37 °C. Avant utilisation, retirez la solution de revêtement à l’aide d’une pipette.
2. Lavez le flacon trois fois avec du PBS, aspirez ensuite le PBS et laissez le flacon T25 sécher à l’air libre.

3. Dissociation des leptoméninges

REMARQUE : Utilisez toujours des tampons et des solutions pré-refroidis à 4 °C.

1. Anesthésiez les souris avec une inhalation excessive de 4% d’isoflurane, puis sacrifiez-les par décapitation rapide à l’aide de ciseaux préalablement nettoyés avec de l’éthanol à 70%.
2. Incisez soigneusement la peau le long de la ligne médiane, en commençant par l’ouverture à l’arrière du crâne et en s’étendant vers la zone frontale.
3. Retirez délicatement le crâne, en le soulevant doucement avec les ciseaux pour éviter d’endommager les leptoméninges, en veillant à ce que tout le cerveau, y compris les leptoméninges, soit obtenu.
4. Plongez tout le cerveau dans un tampon de lavage et rincez-le doucement pour éliminer le sang de surface.
5. Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri stérile sans le hacher et extrayez les leptoméninges de la surface du cerveau à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine sous un microscope.
6. Coupez le tissu leptoméninges en fragments à l’aide de micro-ciseaux stériles.

4. Digestion enzymatique des leptoméninges

1. Ajouter 10 mL du mélange enzymatique (étape 1.2) aux fragments et incuber à 37 °C pendant 15 min. Agitez doucement pour vous assurer que les fragments se détachent du fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 mL de tampon d’arrêt (étape 1.4) pour arrêter la digestion.
2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
3. Ajouter 10 mL de PBS froid et passer le mélange à travers une passoire de 70 μm dans un tube stérile de 50 mL pour filtrer les grumeaux.

5. Expansion cellulaire

1. Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm 2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine (étape²) avec⁵ mL de milieu de culture.
2. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h. Ensuite, retirez le milieu pour éliminer les cellules non attachées.
3. Maintenir la culture en remplaçant 50 % du milieu tous les deux jours. Répétez ce processus deux ou trois fois.

6. Sélection des cellules magnétiques

REMARQUE : Travaillez rapidement, maintenez la froideur des cellules et utilisez des solutions pré-refroidies pour éviter le marquage non spécifique des cellules.

1. Préparation des instruments et des réactifs : fixer un séparateur magnétique sur un support de séparateur magnétique (voir tableau des matériaux). Connectez une colonne de sélection au séparateur magnétique et positionnez une crépine de cellules de 70 μm au sommet de la colonne de sélection. Placez un tube de 50 ml sous la colonne de sélection pour recueillir le débit.
2. Digestion enzymatique : une fois que les cellules ont atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Arrêtez la digestion en ajoutant le tampon d’arrêt. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
3. Incubation des anticorps : remettre en suspension 1 x 10⁷ cellules au total dans 100 μL de PBS et ajouter 10 μL d’anticorps LYVE-1 (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.
   1. Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Rincez les cellules en introduisant 1 mL de PBS et en centrifugeant à 300 x g pendant 5 min. Retirez complètement le surnageant.
4. Marquage des microbilles : remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 20 μL de microbilles (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.
   1. Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et décanter le surnageant. Ensuite, nettoyez les cellules avec 1 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Enfin, retirez complètement le surnageant.
5. Exclusion magnétique négative : remettre les cellules en suspension dans 4 mL de PBS. Passez les cellules à travers une crépine de 70 μm pour éliminer les grumeaux. Préparez la colonne de sélection (voir Tableau des matériaux) en la rinçant avec 3 mL de PBS, puis appliquez la suspension cellulaire dans la colonne de sélection.
   1. Effectuez les étapes de lavage avec 3 mL de PBS et collectez les cellules LYVE-1-négatives dans un tube de 50 mL positionné sous la colonne de sélection pour les laisser passer.
6. Sélection magnétique positive : pipeter 6 mL de PBS dans la colonne de sélection. Rincez instantanément les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne de sélection pour obtenir des LLEC LYVE-1-positifs.
   REMARQUE : Attendez toujours que le réservoir de la colonne de sélection soit vide avant de passer à l’étape suivante.

7. La culture des LLEC

1. Centrifuger les LLEC LYVE-1-positives à 300 x g pendant 5 min, puis retirer délicatement le surnageant.
2. Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm² dans un flacon T25 enrobé de fibronectine avec⁵ mL de milieu de culture.
3. Entretenez la culture en remplaçant 50 % du support tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine et effectuez le passage cellulaire. Utilisez les cellules pour les expériences suivantes après 2-3 passages.

8. Analyse par cytométrie en flux

REMARQUE : L’analyse par cytométrie en flux a été effectuée selon la procédure décrite précédemment¹⁵.

1. Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez le tampon d’arrêt pour arrêter la digestion.
2. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension 1 x 10⁶ cellules dans 100 μL de PBS.
3. Ajouter 1 μL d’anticorps LYVE-1. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.
4. Remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de tampon PBS pour analyse à l’aide de la cytométrie en flux et du logiciel FlowJo (voir le tableau des matériaux).

9. Coloration immunofluorescente

REMARQUE : La coloration par immunofluorescence a été effectuée selon la procédure décrite précédemment¹⁶.

1. Lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante. Jetez le PFA et lavez les cellules avec du PBS trois fois.
2. Appliquer le tampon de bloc pendant 1 h à température ambiante. Retirez le tampon de bloc des lamelles.
3. Ajouter l’anticorps LYVE-1 dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.
4. Ajouter un anticorps secondaire approprié (voir le tableau des matériaux) dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.
5. Contre-coloration avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie d’immunofluorescence.

Résultats

Cette étude présente un protocole reproductible en plusieurs étapes pour le prélèvement de cellules endothéliales lymphatiques (LLECs) chez la souris et l’établissement ultérieur de leur culture primaire in vitro. Les étapes clés comprennent la préparation du flacon et l’enrobage de la fibronectine, la dissociation des leptoméninges, l’obtention d’une suspension unicellulaire par digestion enzymatique et l’induction de l’expansion des LLEC avec le VEGF-C. Les LLEC LYVE-1-positives sont en...

Discussion

Le protocole actuel pour la récolte et la culture in vitro des LLEC n’a pas encore été rapporté. Cette étude présente un protocole multiprocédural reproductible pour la récolte et la culture des LLEC à partir de leptoméninges de souris.

Bien que ce protocole multiprocédural soit reproductible, il y a plusieurs considérations clés. Par exemple, les flacons T25 enrobés de fibronectine favorisent l’adhésion des LLEC et leur fonction en éliminant les cellules non adhé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C