JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Özet

Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerinden açıkça farklı bir dağılıma sahip, yakın zamanda keşfedilen bir intrakraniyal hücresel popülasyondur. Hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, in vitro fonksiyonel araştırma yapmak için bir LLEC arzının mevcudiyeti esastır. Bununla birlikte, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için mevcut bir protokol bulunmamaktadır.

Bu çalışma, şişenin fibronektin ile kaplanmasını, leptomeninglerin mikroskop yardımıyla diseke edilmesini, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için leptomeninglerin enzimatik olarak sindirilmesini, LLEC'lerin vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ile genişlemesini indüklemeyi ve manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS) yoluyla lenfatik damar hyaluronik reseptör-1 (LYVE-1) pozitif hücrelerin seçilmesini içeren çok aşamalı bir protokol kullanarak LLEC'leri başarıyla topladı. Bu süreç nihayetinde birincil bir kültürün kurulmasına yol açtı. LLEC'lerin saflığı, immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi ile doğrulandı ve saflık seviyesi %95'i aştı. Bu çok adımlı protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonunun ve klinik etkilerinin araştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştıracak tekrarlanabilirlik ve fizibilite göstermiştir.

Giriş

Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur 1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.

Fareler, hastalık araştırmalarında genetik manipülasyona uygunlukları nedeniyle tercih edilen hayvan modelidir. Önceki çalışmalar, lenf düğümleri3, mezenterik doku4, dermal doku5, toplayıcı lenfatikler6 ve akciğer dokusu7 dahil olmak üzere çeşitli fare dokularından lenfatik endotel hücrelerini başarıyla izole etmiştir. Bu izolasyon prosedürleri öncelikle manyetik ile aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) ve akış sitometrisi sınıflandırması 8,9,10 gibi tekniklere dayanmaktadır. Ek olarak, araştırma çabaları, sıçan araknoid hücre hatlarının ve sıçan lenfatik kılcal hücre hatlarının kurulmasına yol açmıştır11,12. Leptomeninges13 için eksplant kültür tekniklerinin varlığına rağmen, LLEC'lerin izolasyonu ve kültürü için standart bir protokole acil ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, bu çalışma, bir mikroskop rehberliğinde leptomeningleri titizlikle ayrıştırarak ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) kullanarak LLEC'lerin genişlemesini teşvik ederek LLEC'leri başarıyla hasat etmiş ve kültürlemiştir. Lenfatik endotel hücreleri için ayırt edici belirteç lenfatik damar hyaluronik reseptörü-1'dir (LYVE-1)14. Bu çok adımlı protokol, MACS kullanarak LYVE-1 pozitif LLEC'leri seçici olarak izole eder ve ardından akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama yoluyla saflıklarını doğrular.

Bu çok adımlı protokolün birincil adımları şu şekilde özetlenebilir: şişe kaplama, leptomeninglerin ayrışması, leptomeninglerin enzimatik sindirimi, hücre genişlemesi, manyetik hücre seçimi ve müteakip LLEC kültürü. Son olarak, izole edilen LLEC'lerin saflığı, akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama ile doğrulanır. Bu çalışmanın genel amacı, LLEC'lerin fare leptomeninglerinden izolasyonu ve sonraki in vitro kültürleri için tekrarlanabilir, çok adımlı bir protokol sunmaktır. Bu protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri ile ilgili araştırmaları büyük ölçüde kolaylaştırmaya hazırdır.

Protokol

Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması

NOT: Çözümleri içeren tüm adımlar, sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilmelidir.

  1. Fosfat tamponlu salini (PBS) kalsiyum ve magnezyum, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile karıştırarak yıkama tamponunu hazırlayın (bkz. Bu tamponu 4 °C'de soğuk tutun. Kullanım gününde taze olarak hazırlanması ve tamponun gazının alınması esastır.
  2. 10 mL PBS'yi (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 2 mL% 0.25 tripsin, 1 mL 20 mg / mL papain ve 200 μL 1 mg / mL kollajenaz I ile birleştirerek sindirim enzimlerini hazırlayın (bkz.
    NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için uygun hacimlerde alikotların kullanıldığından emin olun. Bu alikotları -20 °C'de saklayın.
  3. VEGF-C (100 ng/mL) ve %1 P/S içeren, ticari olarak temin edilebilen endotel hücre büyüme ortamı kitini kullanarak kültür ortamını hazırlayın (bkz.
  4. Sindirim sürecini durdurmak için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) %10 FBS ile destekleyerek durdurma tamponunu hazırlayın.
  5. Steril cerrahi aletler hazırlayın: Bu aletler makas, tırtıklı uçlu cımbız ve ince uçlu cımbız içermelidir.

2. Şişe kaplaması

  1. T25 şişesini 100 μg/mL fibronektin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce, bir pipet kullanarak kaplama solüsyonunu çıkarın.
  2. Şişeyi PBS ile üç kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin ve T25 şişesinin kurumasını bekleyin.

3. Leptomeninges ayrışması

NOT: Daima 4 °C'de önceden soğutulmuş tamponlar ve çözeltiler kullanın.

  1. Fareleri% 4 izofluran soluyarak uyuşturun ve daha sonra% 70 etanol ile temizlenmiş makas kullanarak hızlı dekapitasyon ile kurban edin.
  2. Kafatasının arkasındaki açıklıktan başlayarak ve ön bölgeye doğru uzanan cildi orta hat boyunca dikkatlice kesin.
  3. Kafatasını nazikçe çıkarın, leptomeninglere zarar vermemek için makasla hafifçe kaldırın ve leptomeningler de dahil olmak üzere tüm beynin elde edilmesini sağlayın.
  4. Tüm beyni bir yıkama tamponuna batırın ve yüzeydeki kanı çıkarmak için hafifçe yıkayın.
  5. Beyni doğramadan steril bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında ince uçlu cımbız kullanarak leptomeningleri beyin yüzeyinden çıkarın.
  6. Leptomeninges dokusunu steril mikro makas kullanarak parçalara ayırın.

4. Leptomeninges enzimatik sindirim

  1. Parçalara 10 mL enzim karışımı (adım 1.2) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Parçaların tüpün altından ayrıldığından emin olmak için hafifçe çalkalayın. Daha sonra, sindirimi durdurmak için 10 mL durdurma tamponu (adım 1.4) ekleyin.
  2. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  3. 10 mL soğuk PBS ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı filtrelemek için karışımı 70 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik steril bir tüpe geçirin.

5. Hücre genişlemesi

  1. Plaka 1 x 10 cmbaşına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine (adım 2).
  2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat inkübe edin. Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın.
  3. Her iki günde bir ortamın %50'sini değiştirerek kültürü sürdürün. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.

6. Manyetik hücre seçimi

NOT: Hızlı çalışın, hücre soğukluğunu koruyun ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için önceden soğutulmuş solüsyonlar kullanın.

  1. Aletlerin ve reaktiflerin hazırlanması: manyetik bir ayırıcı standına manyetik bir ayırıcı takın (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu bağlayın ve seçim sütununun üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için seçim sütununun altına 50 mL'lik bir tüp yerleştirin.
  2. Enzimatik sindirim: Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Durdurma tamponunu ekleyerek sindirimi durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  3. Antikor inkübasyonu: 100 μL PBS'de 1 x10 7 toplam hücreyi yeniden süspanse edin ve 10 μL LYVE-1 antikoru ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    1. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. 1 mL PBS ekleyerek ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek hücreleri durulayın. Süpernatanı tamamen çıkarın.
  4. Mikro boncuk etiketleme: hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 20 μL Mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    1. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla 1 mL PBS ile temizleyin. Son olarak, süpernatanı tamamen çıkarın.
  5. Manyetik negatif dışlama: hücreleri 4 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Kümeleri ortadan kaldırmak için hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Seçim sütununu (Malzeme Tablosuna bakın) 3 mL PBS ile durulayarak hazırlayın, ardından hücre süspansiyonunu seçim sütununa uygulayın.
    1. 3 mL PBS ile yıkama adımlarını gerçekleştirin ve LYVE-1-negatif hücreleri, geçmelerine izin vermek için seçim sütununun altına yerleştirilmiş 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
  6. Manyetik pozitif seçim: Seçim sütununa 6 mL PBS pipetleyin. LYVE-1 pozitif LLEC'ler elde etmek için pistonu seçim sütununa sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri anında temizleyin.
    NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman seçim sütunu haznesinin boşalmasını bekleyin.

7. LLEC kültürü

  1. LYVE-1-pozitif LLEC'leri 300 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  2. Plaka 1 x 10cm başına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine.
  3. Ortamın %50'sini her gün değiştirerek kültürü koruyun. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve hücre geçişini gerçekleştirin. Hücreleri 2-3 geçişten sonra sonraki deneyler için kullanın.

8. Akış sitometrik analizi

NOT: Flow sitometrik analizi, daha önce açıklanan prosedür15 izlenerek gerçekleştirilmiştir.

  1. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, sindirimi durdurmak için durdurma tamponunu ekleyin.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 100 μL PBS'de 1 x10 6 hücreyi yeniden süspanse edin.
  3. 1 μL LYVE-1 antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
  4. Akış sitometrisi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz için hücreleri uygun miktarda PBS tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).

9. İmmünofloresan boyama

NOT: İmmünofloresan boyama, daha önce açıklanan prosedür izlenerek gerçekleştirilmiştir16.

  1. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Blok tamponunu oda sıcaklığında 1 saat uygulayın. Blok tamponunu lamellerden çıkarın.
  3. Boyama tamponundaki LYVE-1 antikorunu hücrelere ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Boyama tamponuna uygun bir ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) hücrelere ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  5. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama. Hücreler artık immünofloresan mikroskobu için hazırdır.

Sonuçlar

Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre s...

Tartışmalar

LLEC'lerin in vitro olarak toplanması ve kültürlenmesi için mevcut protokol daha önce rapor edilmemiştir. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve kültürlenmesi için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır.

Bu çok prosedürlü protokol tekrarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Örneğin, fibronektin kaplı T25 şişeleri, LLEC'lerin yapışmasını teşvik eder ve yapışmayan hücreleri ortadan kaldırarak işlev g...

Açıklamalar

Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81960226, 81760223), Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045, 202301AY070001-011) ve Yunnan Eyaleti Eğitim Bakanlığı Bilimsel Araştırma Vakfı (2023Y0784) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Block bufferBeyotimeP0102Store aliquots at –4 °C
Collagenase ISolarbioC8140Store aliquots at –20 °C
DAPIBeyotimeP0131Store aliquots at –20 °C
DMEMSolarbio11995Store aliquots at –4 °C
D-PBSSolarbioD1041Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet KitLonzaC-3202Store aliquots at –4 °C
FBSSolarbioS9010Store aliquots at –20 °C
FibronectinSolarbioF8180 Store aliquots at –20 °C
FlowJo SoftwareBD BiosciencesV10.8.1
LYVE-1 antibodyeBioscience12-0443-82Store aliquots at –4 °C
Magnetic separatorMiltenyi130-042-302Sterile before use
Magnetic separator standMiltenyi130-042-303Sterile before use
MicrobeadsMiltenyi130-048-801Store aliquots at –4 °C
P/SSolarbioP1400Store aliquots at –20 °C
PapainSolarbioG8430-25gStore aliquots at –20 °C
PBSSolarbioD1040Store aliquots at –4 °C
PDPN antibodySantasc-53533Store aliquots at –4 °C
PFASolarbioP1110Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibodySantasc-81983Store aliquots at –4 °C
Selection column Miltenyi130-042-401Sterile before use
TrypsinGibco25200072Store aliquots at –20 °C
VEGF-C Abcamab51947Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibodySantasc-514825Store aliquots at –4 °C

Referanslar

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
  3. Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
  4. Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
  5. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  6. Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
  7. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  8. Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
  9. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  10. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
  11. Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
  12. Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
  13. Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
  14. Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
  15. Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
  16. Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
  17. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
  18. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
  19. Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
  20. Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
  21. DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
  22. Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
  23. Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
  24. Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Leptomeningeal Lenfatik Endotel H creleriLLEC lerHasatPrimer K lt rntrakraniyal H cresel Pop lasyonPeriferik Lenfatik Endotel H creleriFonksiyonel Ara t rmaIn VitroProtokolFibronektin KaplamaLeptomeninges DiseksiyonuEnzimatik SindirimTek H creli S spansiyonVask ler Endotelyal B y me Fakt r C VEGF CLenfatik Damar Hyaluronik Resept r 1 LYVE 1Manyetikle Aktive Edilen H cre S n fland rma MACSPrimer K lt r KurulumuSafl k Onaymm nofloresan BoyamaFlow Sitometrik Analiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır