Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.
Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerinden açıkça farklı bir dağılıma sahip, yakın zamanda keşfedilen bir intrakraniyal hücresel popülasyondur. Hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, in vitro fonksiyonel araştırma yapmak için bir LLEC arzının mevcudiyeti esastır. Bununla birlikte, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için mevcut bir protokol bulunmamaktadır.
Bu çalışma, şişenin fibronektin ile kaplanmasını, leptomeninglerin mikroskop yardımıyla diseke edilmesini, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için leptomeninglerin enzimatik olarak sindirilmesini, LLEC'lerin vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ile genişlemesini indüklemeyi ve manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS) yoluyla lenfatik damar hyaluronik reseptör-1 (LYVE-1) pozitif hücrelerin seçilmesini içeren çok aşamalı bir protokol kullanarak LLEC'leri başarıyla topladı. Bu süreç nihayetinde birincil bir kültürün kurulmasına yol açtı. LLEC'lerin saflığı, immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi ile doğrulandı ve saflık seviyesi %95'i aştı. Bu çok adımlı protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonunun ve klinik etkilerinin araştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştıracak tekrarlanabilirlik ve fizibilite göstermiştir.
Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur 1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.
Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması
NOT: Çözümleri içeren tüm adı....
Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre s.......
LLEC'lerin in vitro olarak toplanması ve kültürlenmesi için mevcut protokol daha önce rapor edilmemiştir. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve kültürlenmesi için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır.
Bu çok prosedürlü protokol tekrarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Örneğin, fibronektin kaplı T25 şişeleri, LLEC'lerin yapışmasını teşvik eder ve yapışmayan hücreleri ortadan kaldırarak işlev g.......
Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81960226, 81760223), Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045, 202301AY070001-011) ve Yunnan Eyaleti Eğitim Bakanlığı Bilimsel Araştırma Vakfı (2023Y0784) tarafından desteklenmiştir.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır