Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Özet

Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerinden açıkça farklı bir dağılıma sahip, yakın zamanda keşfedilen bir intrakraniyal hücresel popülasyondur. Hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, in vitro fonksiyonel araştırma yapmak için bir LLEC arzının mevcudiyeti esastır. Bununla birlikte, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için mevcut bir protokol bulunmamaktadır.

Bu çalışma, şişenin fibronektin ile kaplanmasını, leptomeninglerin mikroskop yardımıyla diseke edilmesini, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için leptomeninglerin enzimatik olarak sindirilmesini, LLEC'lerin vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ile genişlemesini indüklemeyi ve manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS) yoluyla lenfatik damar hyaluronik reseptör-1 (LYVE-1) pozitif hücrelerin seçilmesini içeren çok aşamalı bir protokol kullanarak LLEC'leri başarıyla topladı. Bu süreç nihayetinde birincil bir kültürün kurulmasına yol açtı. LLEC'lerin saflığı, immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi ile doğrulandı ve saflık seviyesi %95'i aştı. Bu çok adımlı protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonunun ve klinik etkilerinin araştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştıracak tekrarlanabilirlik ve fizibilite göstermiştir.

Giriş

Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur 1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.

Protokol

Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması

NOT: Çözümleri içeren tüm adı....

Temsili Sonuçlar

Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre s.......

Tartışmalar

LLEC'lerin in vitro olarak toplanması ve kültürlenmesi için mevcut protokol daha önce rapor edilmemiştir. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve kültürlenmesi için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır.

Bu çok prosedürlü protokol tekrarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Örneğin, fibronektin kaplı T25 şişeleri, LLEC'lerin yapışmasını teşvik eder ve yapışmayan hücreleri ortadan kaldırarak işlev g.......

Açıklamalar

Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81960226, 81760223), Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045, 202301AY070001-011) ve Yunnan Eyaleti Eğitim Bakanlığı Bilimsel Araştırma Vakfı (2023Y0784) tarafından desteklenmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Block bufferBeyotimeP0102Store aliquots at –4 °C
Collagenase ISolarbioC8140Store aliquots at –20 °C
DAPIBeyotimeP0131Store aliquots at –20 °C
DMEMSolarbio11995Store aliquots at –4 °C
D-PBSSolarbioD1041Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet KitLonzaC-3202Store aliquots at –4 °C
FBSSolarbioS9010Store aliquots at –20 °C
FibronectinSolarbioF8180 Store aliquots at –20 °C
FlowJo SoftwareBD BiosciencesV10.8.1
LYVE-1 antibodyeBioscience12-0443-82Store aliquots at –4 °C
Magnetic separatorMiltenyi130-042-302Sterile before use
Magnetic separator standMiltenyi130-042-303Sterile before use
MicrobeadsMiltenyi130-048-801Store aliquots at –4 °C
P/SSolarbioP1400Store aliquots at –20 °C
PapainSolarbioG8430-25gStore aliquots at –20 °C
PBSSolarbioD1040Store aliquots at –4 °C
PDPN antibodySantasc-53533Store aliquots at –4 °C
PFASolarbioP1110Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibodySantasc-81983Store aliquots at –4 °C
Selection column Miltenyi130-042-401Sterile before use
TrypsinGibco25200072Store aliquots at –20 °C
VEGF-C Abcamab51947Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibodySantasc-514825Store aliquots at –4 °C

Referanslar

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon