Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Zusammenfassung

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Zusammenfassung

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.

In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.

Einleitung

Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf ^1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protoko....

Protokoll

Diese Forschung wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Alle Versuche hielten sich an die etablierten Richtlinien für die Tierpflege. Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) wurden von männlichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 20-25 g gewonnen. Diese Mäuse wurden von der Medizinischen Universität Kunming in Kunming, China, beschafft. Der gesamte Versuchsablauf wurde unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Vo....

Diskussion

Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.

Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht a.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C