Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Zusammenfassung

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Zusammenfassung

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.

In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.

Einleitung

Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf ^1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Primärkultur von LLECs entwickelt.

Mäuse sind aufgrund ihrer Eignung für die genetische Manipulation in der Krankheitsforschung das bevorzugte Tiermodell. Frühere Studien haben erfolgreich lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Mausgeweben isoliert, darunter Lymphknoten³, Mesenterialgewebe⁴, Hautgewebe⁵, sammelnde Lymphgefäße⁶ und Lungengewebe⁷. Diese Isolierungsverfahren beruhen in erster Linie auf Techniken wie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Durchflusszytometrie ^8,9,10. Darüber hinaus haben die Forschungsbemühungen zur Etablierung von Arachnoidalzelllinien der Ratte und lymphatischen Kapillarzelllinien der Ratte geführt^11,12. Trotz der Existenz von Explantatkulturtechniken für Leptomeninge¹³ besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten Protokoll für die Isolierung und Kultur von LLECs. Folglich wurden in dieser Studie erfolgreich LLECs geerntet und kultiviert, indem Leptomeninge unter Anleitung eines Mikroskops akribisch dissoziiert und die LLEC-Expansion durch den Einsatz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-C (VEGF-C) gefördert wurden. Der charakteristische Marker für lymphatische Endothelzellen ist der lymphatische Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)¹⁴. Dieses mehrstufige Protokoll isoliert selektiv LYVE-1-positive LLECs mittels MACS und verifiziert anschließend ihre Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung.

Die Hauptschritte dieses mehrstufigen Protokolls können wie folgt zusammengefasst werden: Kolbenbeschichtung, Dissoziation von Leptomeningen, enzymatischer Verdau von Leptomeningen, Zellexpansion, magnetische Zellselektion und anschließende Kultur von LLECs. Abschließend wird die Reinheit der isolierten LLECs durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Isolierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus und deren anschließende in vitro Kultur vorzustellen. Dieses Protokoll wird die Untersuchung der zellulären Funktionen und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern.

Protokoll

Diese Forschung wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Alle Versuche hielten sich an die etablierten Richtlinien für die Tierpflege. Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) wurden von männlichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 20-25 g gewonnen. Diese Mäuse wurden von der Medizinischen Universität Kunming in Kunming, China, beschafft. Der gesamte Versuchsablauf wurde unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Instrumenten

HINWEIS: Alle Schritte, bei denen Lösungen zum Einsatz kommen, müssen in einem Biogefahrenschrank der Klasse II durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium, 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) mischen (siehe Materialtabelle). Halten Sie diesen Puffer kalt bei 4 °C. Es ist wichtig, ihn am Tag der Verwendung frisch zuzubereiten und den Puffer zu entgasen.
2. Bereiten Sie die Verdauungsenzyme vor, indem Sie 10 ml PBS (ohne Kalzium und Magnesium) mit 2 ml 0,25%igem Trypsin, 1 ml 20 mg/ml Papain und 200 μl 1 mg/ml Kollagenase I kombinieren (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Aliquots geeigneter Volumina verwenden, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Lagern Sie diese Aliquoten bei -20 °C.
3. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie das handelsübliche Endothelzell-Wachstumsmedium-Kit verwenden, das VEGF-C (100 ng/ml) und 1 % P/S enthält (siehe Materialtabelle).
4. Bereiten Sie den Stopppuffer vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10% FBS ergänzen, um den Verdauungsprozess zu stoppen.
5. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor: Zu diesen Instrumenten sollten eine Schere, eine Pinzette mit gezackter Spitze und eine Pinzette mit feiner Spitze gehören.

2. Kolbenbeschichtung

1. Der T25-Kolben wird mit einer 100 μg/ml Fibronektinlösung bestrichen (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor Gebrauch mit einer Pipette.
2. Waschen Sie den Kolben dreimal mit PBS, saugen Sie anschließend den PBS an und lassen Sie den T25-Kolben an der Luft trocknen.

3. Dissoziation von Leptomeningen

HINWEIS: Verwenden Sie immer vorgekühlte Puffer und Lösungen bei 4 °C.

1. Betäuben Sie die Mäuse mit einer übermäßigen Inhalation von 4 % Isofluran und opfern Sie sie dann durch schnelle Enthauptung mit einer Schere, die zuvor mit 70 % Ethanol gereinigt wurde.
2. Schneiden Sie die Haut vorsichtig entlang der Mittellinie ein, beginnend mit der Öffnung an der Rückseite des Schädels und in Richtung des vorderen Bereichs.
3. Entfernen Sie den Schädel vorsichtig und heben Sie ihn vorsichtig mit der Schere an, um eine Beschädigung der Leptomeninge zu vermeiden und sicherzustellen, dass das gesamte Gehirn, einschließlich der Leptomeninge, erhalten wird.
4. Tauchen Sie das gesamte Gehirn in einen Waschpuffer und spülen Sie ihn vorsichtig aus, um oberflächliches Blut zu entfernen.
5. Übertragen Sie das Gehirn in eine sterile Petrischale, ohne es zu zerkleinern, und extrahieren Sie die Leptomeninge mit einer feinen Pinzette unter einem Mikroskop von der Gehirnoberfläche.
6. Schneiden Sie das Leptomening-Gewebe mit einer sterilen Mikroschere in Fragmente.

4. Enzymatische Verdauung von Leptomeningen

1. Zu den Fragmenten werden 10 ml der Enzymmischung (Schritt 1.2) gegeben und bei 37 °C 15 min inkubiert. Rühren Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Fragmente vom Boden des Röhrchens lösen. Geben Sie anschließend 10 ml Stopppuffer hinzu (Schritt 1.4), um die Verdauung zu stoppen.
2. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
3. Fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu und leiten Sie die Mischung durch ein 70-μm-Sieb in ein steriles 50-ml-Röhrchen, um Klumpen herauszufiltern.

5. Zellausdehnung

1. 1 x 10 5 Zellen pro^cm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben (Schritt 2) mit⁵ ml Nährmedium geben.
2. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 %_CO2 für 24 h inkubiert. Entfernen Sie anschließend das Medium, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
3. Pflegen Sie die Kultur, indem Sie alle zwei Tage 50 % des Mediums austauschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal.

6. Auswahl der Magnetzellen

HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, halten Sie die Zellkälte aufrecht und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen, um eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern.

1. Vorbereitung von Instrumenten und Reagenzien: Befestigen Sie einen Magnetabscheider an einem Magnetabscheiderständer (siehe Materialtabelle). Schließen Sie eine Auswahlsäule an den Magnetabscheider an und positionieren Sie ein 70-μm-Zellsieb auf der Auswahlsäule. Platzieren Sie ein 50-ml-Röhrchen unter der Auswahlsäule, um den Durchfluss aufzufangen.
2. Enzymatische Verdauung: Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie den Stopppuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
3. Antikörper-Inkubation: Resuspendierung von 1 x^{10 7} Gesamtzellen in 100 μl PBS und Zugabe von 10 μl LYVE-1-Antikörper (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
   1. Drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g und verwerfen Sie den Überstand. Spülen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS einführen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
4. Markierung von Mikrokügelchen: Resuspendierung der Zellen in 100 μl PBS und Zugabe von 20 μl Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
   1. Schleudern Sie die Zellen 5 min lang bei 300 x g und dekantieren Sie den Überstand. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml PBS durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min gereinigt. Zum Schluss entfernen Sie den Überstand vollständig.
5. Magnetischer negativer Ausschluss: Resuspendierung der Zellen in 4 ml PBS. Führen Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb, um Klumpen zu entfernen. Bereiten Sie die Auswahlsäule (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie sie mit 3 ml PBS spülen und dann die Zellsuspension in die Auswahlsäule auftragen.
   1. Waschschritte mit 3 ml PBS durchführen und LYVE-1-negative Zellen in einem 50-ml-Röhrchen sammeln, das unterhalb der Auswahlsäule positioniert ist, damit sie passieren können.
6. Magnetische positive Auswahl: Pipettieren Sie 6 ml PBS in die Auswahlspalte. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Auswahlsäule drücken, um LYVE-1-positive LLECs zu erhalten.
   HINWEIS: Warten Sie immer, bis das Auswahlspaltenreservoir leer ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

7. LLEC-Kultur

1. Zentrifugieren Sie die LYVE-1-positiven LLECs bei 300 x g für 5 Minuten und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.
2. 1 x 10 5 Zellen pro^cm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben mit⁵ ml Nährmedium geben.
3. Pflegen Sie die Kultur, indem Sie jeden zweiten Tag 50 % des Mediums austauschen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, trennen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin und führen Sie die Zellpassage durch. Verwenden Sie die Zellen nach 2-3 Durchgängen für nachfolgende Experimente.

8. Durchflusszytometrische Analyse

HINWEIS: Die durchflusszytometrische Analyse wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahren¹⁵ durchgeführt.

1. Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Fügen Sie dann den Stopppuffer hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Resuspendieren Sie 1 x 10⁶ Zellen in 100 μl PBS.
3. Fügen Sie 1 μl LYVE-1-Antikörper hinzu. Gründlich mischen und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge PBS-Puffer für die Analyse mit Durchflusszytometrie und FlowJo-Software (siehe Materialtabelle).

9. Immunfluoreszenz-Färbung

HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahren^{durchgeführt 16}.

1. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
2. Wenden Sie den Blockpuffer 1 h bei Raumtemperatur an. Entfernen Sie den Blockpuffer aus den Deckgläsern.
3. Geben Sie den LYVE-1-Antikörper im Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
4. Geben Sie einen geeigneten Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) in den Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
5. Gegenfärbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die Zellen sind nun bereit für die Immunfluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse

In dieser Studie wird ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Entnahme von lymphatischen Endothelzellen (LLECs) aus Mäusen und die anschließende Etablierung ihrer Primärkultur in vitro vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Kolbenvorbereitung und die Fibronektin-Beschichtung, die Dissoziation von Leptomeningen, die Gewinnung einer Einzelzellsuspension durch enzymatischen Aufschluss und die Induktion der LLEC-Expansion mit VEGF-C. LYVE-1-positive LLECs werden dann selektiv mittels...

Diskussion

Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.

Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C