연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

요약

최근에 확인된 두개내 세포 유형인 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 기능이 잘 이해되지 않습니다. 이 연구는 마우스에서 LLEC를 수확하고 시험관 내 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 LLEC의 세포 기능과 잠재적인 임상적 영향을 탐구할 수 있도록 설계되었습니다.

초록

연수막 림프 내피 세포(LEC)는 최근에 발견된 두개내 세포 집단으로, 말초 림프 내피 세포와 명확하게 구별되는 독특한 분포를 가지고 있습니다. 그들의 세포 기능과 임상적 의미는 거의 알려지지 않았습니다. 결과적으로, LLEC의 공급은 체외에서 기능적 연구를 수행하는 데 필수적입니다. 그러나 현재 시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 없습니다.

이 연구는 플라스크를 피브로넥틴으로 코팅하고, 현미경을 사용하여 렙토메닝을 해부하고, 렙토메닝을 효소로 소화하여 단세포 현탁액을 준비하고, 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)로 LLEC의 확장을 유도하고, 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 림프관 히알루론산 수용체-1(LYVE-1) 양성 세포를 선택하는 등 다단계 프로토콜을 사용하여 LLEC를 성공적으로 수확했습니다. 이 과정은 궁극적으로 1차 문화의 확립으로 이어졌다. LLEC의 순도는 면역형광 염색 및 유세포 분석을 통해 확인되었으며, 순도는 95%를 초과했습니다. 이 다단계 프로토콜은 재현성과 타당성을 입증했으며, 이는 LLEC의 세포 기능 및 임상적 의미에 대한 탐구를 크게 촉진할 것입니다.

서문

새로 발견된 렙토메닝 림프 내피 세포(LEC)는 렙토메닝 내에서 개별 세포의 그물망을 형성하여 말초 림프 내피 세포와 비교할 때 뚜렷한 분포 패턴을 나타냅니다 ^1,2. LLEC와 관련된 세포 기능 및 임상적 의미는 여전히 미지의 영역으로 남아 있습니다. LLEC에 대한 기능적 연구의 길을 닦기 위해서는 연구를 위한 체외 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 따라서 본 연구는 LLEC의 격리 및 1차 배양에 대한 포괄적인 프로토콜을 고안했습니다.

마우스는 질병 연구에서 유전자 조작에 적합하기 때문에 선호되는 동물 모델입니다. 이전 연구에서는 림프절³, 장간막 조직⁴, 피부 조직⁵, 수집 림프관⁶ 및 폐 조직⁷을 포함한 다양한 마우스 조직에서 림프 내피 세포를 성공적으로 분리했습니다. 이러한 분리 절차는 주로 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 유세포 분석^분류 8,9,10과 같은 기술에 의존해 왔습니다. 또한, 연구 노력은 쥐 거미막 세포주와 쥐 림프 모세관 세포주^11,12의 확립으로 이어졌습니다. 렙토메닝(leptomeninges)에 대한 외식물 배양 기법이 존재함에도 불구하고(¹³), LLEC의 분리 및 배양을 위한 표준화된 프로토콜이 시급히 필요하다. 결과적으로 이 연구는 현미경의 유도 하에 렙토메닝을 꼼꼼하게 해리하고 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)를 사용하여 LLEC의 확장을 촉진하여 LLEC를 성공적으로 수확 및 배양했습니다. 림프 내피 세포의 독특한 표지자는 림프관 히알루론산 수용체-1(lyve-1)입니다¹⁴. 이 다단계 프로토콜은 MACS를 사용하여 LYVE-1 양성 LLEC를 선택적으로 분리한 후 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 순도를 검증합니다.

이 다단계 프로토콜의 주요 단계는 플라스크 코팅, 렙토메닝의 해리, 렙토메닝의 효소 분해, 세포 확장, 자기 세포 선택 및 LLEC의 후속 배양으로 요약할 수 있습니다. 마지막으로, 분리된 LLEC의 순도는 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 확인됩니다. 이 연구의 가장 중요한 목표는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 분리하고 후속 시험관 내 배양을 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이 프로토콜은 LLEC의 세포 기능 및 임상적 영향에 대한 조사를 크게 촉진할 준비가 되어 있습니다.

프로토콜

본 연구는 쿤밍의과대학 동물실험윤리위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았다. 모든 실험은 확립된 동물 관리 지침을 준수했습니다. 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 6-8주 되고 체중이 20-25g인 수컷 C57Bl/6J 마우스로부터 수확했습니다. 이 쥐들은 중국 쿤밍에 있는 쿤밍 의과대학에서 조달했다. 전체 실험 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행되었습니다. 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다.

1. 시약 및 기구 준비

알림: 용액과 관련된 모든 단계는 클래스 II 생물학적 위험 캐비닛 내에서 수행해야 합니다.

1. 인산염 완충 식염수(PBS)를 칼슘 및 마그네슘, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)과 혼합하여 세척 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조). 이 버퍼를 4°C에서 차갑게 유지하십시오. 사용 당일에 신선하게 준비하고 완충액의 가스를 제거하는 것이 중요합니다.
2. 10mL의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외)를 0.25% 트립신 2mL, 20mg/mL 파파인 1mL, 1mg/mL 콜라겐분해효소 I 200μL와 결합하여 소화 효소를 준비합니다( 재료 표 참조).
   알림: 반복적인 동결-해동 주기를 방지하기 위해 적절한 부피의 부분 표본을 사용하십시오. 이 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
3. VEGF-C(100ng/mL) 및 1% P/S를 포함하는 시판되는 내피 세포 성장 배지 키트를 활용하여 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
4. 분해 과정을 중지하기 위해 10% FBS로 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 보충하여 중지 완충액을 준비합니다.
5. 멸균 수술 기구 준비: 이러한 기구에는 가위, 톱니 모양의 팁 핀셋 및 미세한 핀셋이 포함되어야 합니다.

2. 플라스크 코팅

1. T25 플라스크에 100μg/mL 피브로넥틴 용액( 재료 표 참조)을 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 사용하기 전에 피펫을 사용하여 코팅 용액을 제거하십시오.
2. PBS로 플라스크를 세 번 세척한 다음 PBS를 흡입하고 T25 플라스크를 자연 건조시킵니다.

3. 렙토메닝 해리

알림: 항상 4°C에서 미리 냉각된 완충액과 용액을 사용하십시오.

1. 4% 이소플루란을 과도하게 흡입하여 쥐를 마취한 다음 이전에 70% 에탄올로 세척한 가위를 사용하여 신속하게 목을 베어 희생합니다.
2. 두개골 뒤쪽의 구멍에서 시작하여 전두엽 부위로 뻗어 정중선을 따라 피부를 조심스럽게 절개합니다.
3. 두개골을 조심스럽게 제거하고 가위로 부드럽게 들어 올려 연수막을 손상시키지 않도록 하여 연수막을 포함한 뇌 전체를 얻습니다.
4. 뇌 전체를 세척 완충액에 담그고 부드럽게 씻어내어 표면 혈액을 제거합니다.
5. 뇌를 자르지 않고 멸균된 페트리 접시에 옮기고 현미경으로 미세한 핀셋을 사용하여 뇌 표면에서 렙토메닝을 추출합니다.
6. 멸균 마이크로 가위를 사용하여 렙토메닝 조직을 조각으로 자릅니다.

4. 렙토메닝 효소 소화

1. 효소 혼합물 10mL(단계 1.2)를 단편에 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 조각이 튜브 바닥에서 분리되도록 부드럽게 저어줍니다. 그 후, 10mL의 정지 완충액(1.4단계)을 추가하여 분해를 중단시킵니다.
2. 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 콜드 PBS 10mL를 넣고 혼합물을 70μm 스트레이너를 통해 멸균 50mL 튜브에 통과시켜 덩어리를 걸러냅니다.

5. 세포 확장

1. 1 x 10 cm^{당 5}개 세포를 5mL의 배양 배지로 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크(2단계)에 플레이트 2개로 만듭니다.
2. 37°C에서 5%_CO2 로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
3. 이틀에 한 번씩 배지의 50%를 교체하여 배양을 유지합니다. 이 과정을 두세 번 반복한다.

6. 마그네틱 셀 선택

알림: 신속하게 작업하고, 셀 냉각을 유지하고, 사전 냉각된 용액을 활용하여 비특이적 셀 라벨링을 방지합니다.

1. 기기 및 시약 준비: 자기 분리기를 자기 분리기 스탠드에 부착합니다( 재료 표 참조). 선택 컬럼을 자기 분리기에 연결하고 70μm 셀 스트레이너를 선택 컬럼 위에 배치합니다. 선택 컬럼 아래에 50mL 튜브를 놓아 흐름을 수집합니다.
2. 효소 분해: 세포가 80% 합류에 도달하면 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 헹굽니다. 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 중지 버퍼를 추가하여 분해를 중지합니다. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
3. 항체 배양: 100μL의 PBS에 1 x 10⁷ 개의 총 세포를 재현탁시키고 10μL의 LYVE-1 항체를 추가합니다( 재료 표 참조). 잘 섞고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
   1. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 버립니다. PBS 1mL를 주입하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 헹굽니다. 상층액을 완전히 제거하십시오.
4. 마이크로비즈 라벨링: 100μL의 PBS에 세포를 재현탁시키고 20μL의 마이크로비즈를 추가합니다( 재료 표 참조). 잘 섞고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
   1. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 디캔팅합니다. 그 후, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리를 통해 PBS 1mL로 세포를 세척합니다. 마지막으로 상층액을 완전히 제거합니다.
5. 자기 음성 배제: 4mL의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다. 70μm 셀 스트레이너에 세포를 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 선택 컬럼( 재료 표 참조)을 3mL의 PBS로 헹구어 준비한 다음 셀 현탁액을 선택 컬럼에 적용합니다.
   1. 3mL의 PBS로 세척 단계를 수행하고 LYVE-1-음성 세포를 선택 컬럼 아래에 위치한 50mL 튜브에 수집하여 통과시킬 수 있도록 합니다.
6. 자기 양성 선택: PBS 6mL를 선택 컬럼에 피펫팅합니다. 플런저를 선택 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 세포를 즉시 플러시하여 LYVE-1 양성 LLEC를 얻습니다.
   알림: 다음 단계로 진행하기 전에 항상 선택 열 저장소가 비워질 때까지 기다리십시오.

7. LLEC의 문화

1. LYVE-1 양성 LLEC를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
2. 1 x 10^{cm당 5}개 세포를 5mL의 배양 배지가 있는 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크에 2개 플레이트로 만듭니다.
3. 이틀에 한 번씩 배지의 50%를 교체하여 배양을 유지합니다. 세포가 80% 합류에 도달하면 0.25% 트립신으로 세포를 분리하고 세포 통과를 수행합니다. 2-3 통과 후 후속 실험을 위해 세포를 활용하십시오.

8. 유세포 분석

참고: 유세포 분석은 앞서 설명한 절차¹⁵에 따라 수행되었습니다.

1. 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 중지 버퍼를 추가하여 소화를 중지합니다.
2. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 완전히 흡인합니다. 1 x 10⁶ 세포를 100 μL의 PBS에 재현탁시킵니다.
3. LYVE-1 항체 1μL를 추가합니다. 잘 섞고 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.
4. 유세포 분석 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 적절한 양의 PBS 완충액에 세포를 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).

9. 면역형광 염색

참고: 면역형광 염색은 앞서 설명한 절차에 따라^{수행되었습니다 16}.

1. PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 실온에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 10분 동안 고정합니다. PFA를 버리고 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.
2. 실온에서 1시간 동안 블록 버퍼를 적용합니다. 커버슬립에서 블록 버퍼를 제거합니다.
3. 염색 완충액의 LYVE-1 항체를 세포에 추가하고 어두운 곳에서 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
4. 염색 완충액에 적절한 2차 항체( 재료 표 참조)를 세포에 추가하고 어두운 곳에서 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
5. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색. 이제 세포는 면역형광 현미경 검사를 받을 준비가 되었습니다.

결과

이 연구는 생쥐에서 림프 내피 세포(LEC)를 채취한 후 시험관 내에서 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시합니다. 주요 단계에는 플라스크 준비 및 피브로넥틴 코팅, 렙토메닝의 해리, 효소 분해를 통한 단세포 현탁액 획득, VEGF-C로 LLEC 확장 유도가 포함됩니다. 그런 다음 LYVE-1 양성 LLEC를 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 선택적으로 분리합니다. 마지막으로, ...

토론

시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 이전에 보고된 적이 없습니다. 이 연구는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 재현 가능한 다중 절차 프로토콜을 소개합니다.

이 다중 절차 프로토콜은 재현 가능하지만 몇 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 예를 들어, 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크는 비부착 세포를 제거함으로써 LLEC의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C