Colheita e Cultura Primária de Células Endoteliais Linfáticas Leptomeníngeas

Resumo

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.

Resumo

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) são uma população celular intracraniana recentemente descoberta com uma distribuição única claramente distinta das células endoteliais linfáticas periféricas. Sua função celular e implicações clínicas permanecem em grande parte desconhecidas. Consequentemente, a disponibilidade de um suprimento de LLECs é essencial para a realização de pesquisas funcionais in vitro. No entanto, atualmente não existe um protocolo para colheita e cultivo de LLECs in vitro.

Este estudo colheu LLECs com sucesso usando um protocolo de várias etapas, que incluiu o revestimento do frasco com fibronectina, dissecando as leptomeninges com o auxílio de um microscópio, digerindo enzimaticamente as leptomeninges para preparar uma suspensão de célula única, induzindo a expansão de LLECs com fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) e selecionando células positivas para receptor hialurônico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1) através de triagem celular ativada por magnetismo (MACS). Esse processo acabou levando ao estabelecimento de uma cultura primária. A pureza dos LLECs foi confirmada através da coloração por imunofluorescência e análise por citometria de fluxo, com um nível de pureza superior a 95%. Este protocolo de várias etapas demonstrou reprodutibilidade e viabilidade, o que facilitará sobremaneira a exploração da função celular e as implicações clínicas dos LLECs.

Introdução

As recém-descobertas células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) formam uma malha de células individuais dentro das leptomeninges, exibindo um padrão de distribuição distinto quando comparadas às células endoteliais linfáticas periféricas ^1,2. As funções celulares e as implicações clínicas associadas aos LLECs permanecem em grande parte território desconhecido. A fim de abrir caminho para a pesquisa funcional em LLECs, é imperativo estabelecer um modelo in vitro para o seu estudo. Portanto, este estudo elaborou um protocolo abrangente para o isolamento e cultura primária de LLECs.

Camundongos são o modelo animal preferido devido à sua adequação para manipulação genética em pesquisas de doenças. Estudos prévios isolaram com sucesso células endoteliais linfáticas de vários tecidos de camundongos, incluindo linfonodos³, tecido mesentérico⁴, tecido dérmico⁵, linfáticos coletores⁶ e tecido pulmonar⁷. Esses procedimentos de isolamento têm se baseado principalmente em técnicas como a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e a classificação por citometria de fluxo ^8,9,10. Além disso, esforços de pesquisa levaram ao estabelecimento de linhagens de células aracnoides de ratos e linhagens de células capilares linfáticas de^ratos11,12. Apesar da existência de técnicas de cultura de explantes para leptomeninges¹³, existe uma necessidade urgente de um protocolo padronizado para o isolamento e cultivo de LLECs. Consequentemente, este estudo colheu e cultivou com sucesso LLECs dissociando meticulosamente leptomeninges sob a orientação de um microscópio e promovendo a expansão de LLECs através do uso do fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C). O marcador distintivo das células endoteliais linfáticas é o receptor hialurônico dos vasos linfáticos-1 (LYVE-1)¹⁴. Este protocolo de várias etapas isola seletivamente LLECs LYVE-1-positivos usando MACS e, posteriormente, verifica sua pureza através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência.

As etapas primárias deste protocolo de várias etapas podem ser resumidas da seguinte forma: revestimento do frasco, dissociação de leptomeninges, digestão enzimática de leptomeninges, expansão celular, seleção de células magnéticas e subsequente cultura de LLECs. Finalmente, a pureza dos LLECs isolados é confirmada através de análise por citometria de fluxo e coloração por imunofluorescência. O objetivo geral deste estudo é apresentar um protocolo reprodutível em várias etapas para o isolamento de LLECs de leptomeninges de camundongos e seu subsequente cultivo in vitro . Este protocolo está pronto para facilitar muito as investigações sobre as funções celulares e implicações clínicas dos LLECs.

Protocolo

Esta pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Kunming Medical University (kmmu20220945). Todos os experimentos seguiram as diretrizes estabelecidas para os cuidados com os animais. Células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs) foram coletadas de camundongos machos C57Bl/6J com idade entre 6-8 semanas e peso entre 20-25 g. Esses camundongos foram adquiridos da Universidade de Medicina de Kunming, em Kunming, na China. Todo o procedimento experimental foi conduzido sob rigorosas condições estéreis. Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente, salvo especificação em contrário.

1. Preparação de reagentes e instrumentos

NOTA: Todas as etapas que envolvem soluções devem ser conduzidas dentro de um gabinete de risco biológico classe II.

1. Preparar o tampão de lavagem misturando solução salina tamponada com fosfato (PBS) com cálcio e magnésio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) (ver Tabela de Materiais). Mantenha este tampão frio a 4 °C. É essencial prepará-lo fresco no dia do uso e desgaseificar o tampão.
2. Preparar as enzimas digestivas combinando 10 mL de PBS (sem cálcio e magnésio) com 2 mL de tripsina a 0,25%, 1 mL de papaína 20 mg/mL e 200 μL de 1 mg/mL de colagenase I (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Garantir o uso de alíquotas de volumes apropriados para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Conservar estas alíquotas a -20 °C.
3. Preparar o meio de cultura utilizando o kit de meio de crescimento de células endoteliais disponível comercialmente, que inclui VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (ver Tabela de Materiais).
4. Prepare o tampão de parada suplementando o meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% de FBS para interromper o processo de digestão.
5. Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis: esses instrumentos devem incluir tesouras, pinças de ponta serrilhada e pinças de ponta fina.

2. Revestimento do frasco

1. Cobrir o balão T25 com uma solução de fibronectina a 100 μg/ml (ver Tabela de Materiais) e incubar durante a noite a 37 °C. Antes de usar, remova a solução de revestimento usando uma pipeta.
2. Lavar o frasco três vezes com PBS, aspirar posteriormente o PBS e deixar o frasco T25 secar ao ar.

3. Dissociação das leptomeninges

NOTA: Utilize sempre tampões e soluções pré-arrefecidos a 4 °C.

1. Anestesiar os camundongos com inalação excessiva de isoflurano a 4% e, em seguida, sacrificá-los por decapitação rápida usando tesouras previamente limpas com etanol 70%.
2. Inciso cuidadosamente a pele ao longo da linha média, começando pela abertura na parte de trás do crânio e estendendo-se em direção à área frontal.
3. Remova delicadamente o crânio, levantando-o suavemente com a tesoura para evitar danificar as leptomeninges, garantindo que todo o cérebro, incluindo as leptomeninges, seja obtido.
4. Submerja todo o cérebro em um tampão de lavagem e lave-o suavemente para remover o sangue da superfície.
5. Transfira o cérebro para uma placa de Petri estéril sem cortar e extraia as leptomeninges da superfície do cérebro usando pinças de ponta fina sob um microscópio.
6. Cortar o tecido das leptomeninges em fragmentos usando microtesouras estéreis.

4. Digestão enzimática das leptomeninges

1. Adicionar 10 ml da mistura enzimática (passo 1.2) aos fragmentos e incubar a 37 °C durante 15 minutos. Agite suavemente para garantir que os fragmentos se desprendem do fundo do tubo. Depois, adicionar 10 ml de tampão de paragem (passo 1.4) para interromper a digestão.
2. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C e remover cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta.
3. Adicione 10 mL de PBS frio e passe a mistura através de um filtro de 70 μm em um tubo estéril de 50 mL para filtrar quaisquer aglomerações.

5. Expansão celular

1. Placa 1 x 10 5 células por cm 2 em frasco T25 revestido com fibronectina (passo²) com⁵ mL de meio de cultura.
2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 horas. Depois, remova o meio para eliminar as células não aderidas.
3. Manter a cultura substituindo 50% do meio a cada dois dias. Repita esse processo duas ou três vezes.

6. Seleção de células magnéticas

NOTA: Trabalhe rapidamente, mantenha a frieza da célula e utilize soluções pré-resfriadas para evitar a marcação celular não específica.

1. Preparação de instrumentos e reagentes: fixar um separador magnético a um suporte separador magnético (ver Tabela de Materiais). Conecte uma coluna de seleção ao separador magnético e posicione um filtro de células de 70 μm no topo da coluna de seleção. Coloque um tubo de 50 mL abaixo da coluna de seleção para coletar o fluxo.
2. Digestão enzimática: uma vez que as células atinjam 80% de confluência, aspirar o meio e enxaguar as células com PBS. Adicionar tripsina a 0,25% para destacar as células aderentes e incubar a 37 °C por 5 min. Pare a digestão adicionando o buffer de parada. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
3. Incubação de anticorpos: ressuspender 1 x 10⁷ células totais em 100 μL de PBS e adicionar 10 μL de anticorpo LYVE-1 (ver Tabela de Materiais). Misture bem e incube durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
   1. Gire as células a 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Enxaguar as células introduzindo 1 mL de PBS e centrifugando a 300 x g por 5 min. Remova completamente o sobrenadante.
4. Marcação de microesferas : ressuspender as células em 100 μL de PBS e adicionar 20 μL de Microesferas (ver Tabela de Materiais). Misture bem e incube durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
   1. Gire as células a 300 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Em seguida, limpar as células com 1 mL de PBS através de centrifugação a 300 x g por 5 min. Por fim, remova completamente o sobrenadante.
5. Exclusão magnética negativa: ressuspender as células em 4 mL de PBS. Passe as células através de um filtro celular de 70 μm para eliminar aglomerações. Prepare a coluna de seleção (consulte Tabela de Materiais) enxaguando-a com 3 mL de PBS e, em seguida, aplique a suspensão de células na coluna de seleção.
   1. Execute as etapas de lavagem com 3 mL de PBS e colete as células negativas para LYVE-1 em um tubo de 50 mL posicionado abaixo da coluna de seleção para permitir a sua passagem.
6. Seleção positiva magnética: pipetar 6 mL de PBS na coluna de seleção. Elimine instantaneamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna de seleção para obter LLECs positivos para LYVE-1.
   Observação : sempre aguarde até que o reservatório da coluna de seleção está vazio antes de prosseguir para a próxima etapa.

7. Cultura de LLECs

1. Centrifugar os LLECs positivos para LYVE-1 a 300 x g por 5 minutos e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante.
2. Placa 1 x 10 5 células por cm² em frasco T25 revestido com fibronectina com⁵ mL de meio de cultura.
3. Manter a cultura substituindo 50% do meio a cada dois dias. Quando as células atingirem 80% de confluência, desprender as células com 0,25% de tripsina e realizar a passagem celular. Utilizar as células para experimentos subsequentes após 2-3 passagens.

8. Análise por citometria de fluxo

OBS: A análise por citometria de fluxo foi realizada seguindo o procedimento descrito^{anteriormente15}.

1. Adicionar tripsina a 0,25% para destacar as células aderentes e incubar a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione o tampão de parada para interromper a digestão.
2. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspender 1 x 10⁶ células em 100 μL de PBS.
3. Adicionar 1 μL do anticorpo LYVE-1. Misture bem e incube por 10 min no escuro à temperatura ambiente.
4. Ressuspender as células em uma quantidade apropriada de tampão PBS para análise usando citometria de fluxo e software FlowJo (consulte Tabela de Materiais).

9. Coloração por imunofluorescência

OBS: A coloração por imunofluorescência foi realizada seguindo o procedimento descrito anteriormente¹⁶.

1. Lave as células com PBS três vezes. Fixar as células com paraformaldeído (PFA) a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o PFA e lave as células com PBS três vezes.
2. Aplique o tampão de bloco durante 1 h à temperatura ambiente. Remova o buffer de bloco das lamínulas.
3. Adicione o anticorpo LYVE-1 no tampão de coloração às células e incube no escuro. Lave as células três vezes com PBS.
4. Adicione um anticorpo secundário apropriado (ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração às células e incube no escuro. Lave as células três vezes com PBS.
5. Contracoloração com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). As células já estão prontas para a microscopia de imunofluorescência.

Resultados

Este estudo apresenta um protocolo reprodutível de várias etapas para a coleta de células endoteliais linfáticas (LLECs) de camundongos e, posteriormente, estabelecimento de sua cultura primária in vitro. As principais etapas envolvem a preparação do frasco e o revestimento da fibronectina, a dissociação das leptomeninges, a obtenção de uma suspensão unicelular por digestão enzimática e a indução da expansão dos LLECs com VEGF-C. LLECs LYVE-1-positivos são então seletivamente isolados usando c...

Discussão

O protocolo existente para colheita e cultivo de LLECs in vitro não foi relatado anteriormente. Este estudo apresenta um protocolo multiprocedimento reprodutível para coleta e cultivo de LLECs de leptomeninges de camundongos.

Embora esse protocolo multiprocedimento seja reprodutível, há várias considerações importantes. Por exemplo, frascos T25 revestidos com fibronectina promovem a adesão de LLECs e funcionam eliminando células não aderentes, garantindo assim uma populaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C