קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

Summary

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

Abstract

תאי אנדותל לימפטיים לפטומנינגיאליים (LLECs) הם אוכלוסיית תאים תוך-גולגולתיים שהתגלתה לאחרונה עם תפוצה ייחודית הנבדלת בבירור מתאי אנדותל לימפטיים היקפיים. תפקודם התאי והשלכותיהם הקליניות עדיין אינם ידועים במידה רבה. כתוצאה מכך, הזמינות של אספקת LLECs חיונית לביצוע מחקר פונקציונלי במבחנה. עם זאת, אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול LLECs במבחנה.

מחקר זה אסף בהצלחה LLECs באמצעות פרוטוקול רב-שלבי, שכלל ציפוי הבקבוק בפיברונקטין (FIBRONECTIN), ניתוח הלפטומנינגים בעזרת מיקרוסקופ, עיכול אנזימטי של הלפטומנינגים כדי להכין תרחיף חד-תאי, גרימת התרחבות של LLECs עם גורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C), ובחירת תאים חיוביים קולטן היאלורוני של כלי הלימפה -1 (LYVE-1) באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תהליך זה הוביל בסופו של דבר לכינונה של תרבות ראשונית. טוהר ה- LLECs אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי זרימה, עם רמת טוהר העולה על 95%. פרוטוקול רב-שלבי זה הוכיח יכולת שחזור והיתכנות, אשר יקלו מאוד על חקר התפקוד התאי וההשלכות הקליניות של LLECs.

Introduction

תאי אנדותל לימפה לפטומנינגיאליים שהתגלו לאחרונה (LLECs) יוצרים רשת של תאים בודדים בתוך הלפטומנינגים, ומציגים דפוס התפלגות מובהק בהשוואה לתאי אנדותל לימפטיים היקפיים ^1,2. התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות הקשורות ל-LLECs נותרו במידה רבה טריטוריה לא ממופת. על מנת לסלול את הדרך למחקר פונקציונלי על LLECs, הכרחי להקים מודל in vitro עבור המחקר שלהם. לכן, מחקר זה פיתח פרוטוקול מקיף לבידוד ותרבות ראשונית של LLECs.

עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל התאמתם למניפולציה גנטית בחקר מחלות. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה תאי אנדותל לימפטיים מרקמות עכבר שונות, כולל בלוטות לימפה³, רקמה מזנטרית⁴, רקמת עור⁵, איסוף לימפה⁶ ורקמת ריאה⁷. הליכי בידוד אלה הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) ומיון ציטומטריית זרימה ^8,9,10. בנוסף, מאמצי המחקר הובילו להקמת קווי תאים ארכנואידים של חולדות וקווי תאי נימים לימפטיים של חולדות^11,12. למרות קיומן של טכניקות תרבית צמחים עבור לפטומנינגה¹³, קיים צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי לבידוד ותרבית של LLECs. כתוצאה מכך, מחקר זה הצליח לקצור ולתרבת LLECs על ידי ניתוק קפדני של לפטומנינגים בהנחיית מיקרוסקופ וקידום הרחבת LLECs באמצעות שימוש בגורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C). הסמן הייחודי לתאי אנדותל לימפטיים הוא קולטן היאלורוני של כלי הלימפה-1 (LYVE-1)¹⁴. פרוטוקול רב-שלבי זה מבודד באופן סלקטיבי LLECs חיוביים ל-LYVE-1 באמצעות MACS ולאחר מכן מוודא את טוהרם באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

ניתן לסכם את השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-שלבי זה באופן הבא: ציפוי בקבוקים, דיסוציאציה של לפטומנינגים, עיכול אנזימטי של לפטומנינגים, התפשטות תאים, בחירת תאים מגנטיים ותרבית עוקבת של LLECs. לבסוף, טוהר ה- LLECs המבודדים מאושר באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית. מטרת העל של מחקר זה היא להציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לבידוד LLECs מלפטומינינגים של עכברים ומתרבית המבחנה שבאה בעקבותיהם. פרוטוקול זה צפוי להקל מאוד על חקירת התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות של LLECs.

Protocol

מחקר זה קיבל אישור מוועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). כל הניסויים עמדו בהנחיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים. תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs) נלקחו מעכברים זכרים C57Bl/6J בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל בין 20-25 גרם. עכברים אלה נרכשו מהאוניברסיטה הרפואית של קונמינג בקונמינג, סין. ההליך הניסיוני כולו נערך בתנאים סטריליים קפדניים. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. הכנת ריאגנטים ומכשירים

הערה: כל השלבים הכוללים פתרונות חייבים להתבצע בתוך ארון סיכונים ביולוגיים סוג II.

1. הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב מלח חוצץ פוספט (PBS) עם סידן ומגנזיום, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים). שמור על חיץ זה קר ב 4 °C. חשוב להכין אותו טרי ביום השימוש ולנטרל את החיץ.
2. הכינו את אנזימי העיכול על ידי שילוב של 10 מ"ל PBS (ללא סידן ומגנזיום) עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, 1 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל פפאין, ו-200 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז I (ראו טבלת חומרים).
   הערה: הקפד להשתמש ב- aliquots של אמצעי אחסון מתאימים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. אחסן aliquots אלה ב -20 °C.
3. הכינו את מדיום התרבית על ידי שימוש בערכת מדיום גידול תאי אנדותל הזמינה מסחרית, הכוללת VEGF-C (100 ננוגרם/מ"ל) ו-1% P/S (ראו טבלת חומרים).
4. הכינו את מאגר העצירה על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 10% FBS כדי לעצור את תהליך העיכול.
5. הכינו כלי ניתוח סטריליים: מכשירים אלה צריכים לכלול מספריים, פינצטה משוננת ופינצטה עדינה.

2. ציפוי בקבוקון

1. מצפים את בקבוק T25 בתמיסת פיברונקטין 100 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ודגרים למשך הלילה ב-37°C. לפני השימוש יש להסיר את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.
2. שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן שאפו את PBS, ואפשרו לבקבוק T25 להתייבש באוויר.

3. דיסוציאציה Leptomeninges

הערה: השתמש תמיד במאגרים ותמיסות מקוררים מראש בטמפרטורה של 4°C.

1. מרדימים את העכברים בשאיפה עודפת של 4% איזופלורן ולאחר מכן מקריבים אותם על ידי עריפת ראש מהירה באמצעות מספריים שנוקו בעבר עם 70% אתנול.
2. יש לחתוך בזהירות את העור לאורך קו האמצע, החל מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת ועד לאזור הקדמי.
3. הסר בעדינות את הגולגולת, הרים אותה בעדינות עם המספריים כדי למנוע נזק leptomeninges, להבטיח את המוח כולו, כולל leptomeninges, מתקבל.
4. השקיעו את כל המוח במאגר כביסה ושטפו אותו בעדינות כדי להסיר דם משטח.
5. מעבירים את המוח לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, ומחלצים את הלפטומנינגים מפני השטח של המוח באמצעות פינצטה עדינה תחת מיקרוסקופ.
6. חותכים את רקמת הלפטומנינגס לשברים באמצעות מיקרו-מספריים סטריליים.

4. Leptomeninges עיכול אנזימטי

1. מוסיפים 10 מ"ל של תערובת האנזימים (שלב 1.2) למקטעים ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. יש להתסיס בעדינות כדי להבטיח שהשברים יתנתקו מתחתית הצינור. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של חיץ עצירה (שלב 1.4) כדי לעצור את העיכול.
2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה.
3. מוסיפים 10 מ"ל PBS קר, ומעבירים את התערובת דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי של 50 מ"ל כדי לסנן את כל הגושים.

5. הרחבת תאים

1. צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ 2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין (שלב²) עם⁵ מ"ל של מדיום תרבית.
2. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 24 שעות. לאחר מכן, הסר את המדיום כדי לחסל תאים שאינם מחוברים.
3. לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.

6. בחירת תאים מגנטיים

הערה: עבוד במהירות, שמור על קור התאים והשתמש בתמיסות מקוררות מראש כדי למנוע תיוג תאים לא ספציפי.

1. הכנת מכשירים וריאגנטים: מחברים מפריד מגנטי למעמד מפריד מגנטי (ראה טבלת חומרים). חבר עמודת בחירה למפריד המגנטי ומקם מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר על גבי עמודת הבחירה. מקם צינור של 50 מ"ל מתחת לעמודת הבחירה כדי לאסוף את הזרימה.
2. עיכול אנזימטי: ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, שואפים את התווך ושוטפים את התאים עם PBS. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת מאגר העצירה. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
3. דגירה של נוגדנים: להשהות מחדש 1 x 10⁷ תאים סה"כ ב 100 μL של PBS ולהוסיף 10 μL של נוגדן LYVE-1 (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב-18 מעלות.
   1. סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. שטוף את התאים על ידי החדרת 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.
4. תיוג מיקרו-כדוריות: יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 20 מיקרו-כדוריות (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.
   1. סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו decant את supernatant. לאחר מכן, לנקות את התאים עם 1 מ"ל של PBS באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לבסוף, להסיר לחלוטין את supernatant.
5. הרחקה שלילית מגנטית: להשעות מחדש את התאים ב 4 מ"ל של PBS. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק גושים. הכינו את עמודת הבחירה (ראו טבלת חומרים) על-ידי שטיפתה ב-3 מ"ל PBS, ולאחר מכן החילו את תרחיף התא בעמודת הבחירה.
   1. בצעו שלבי שטיפה עם 3 מ"ל PBS ואספו תאים שליליים מסוג LYVE-1 לתוך צינור של 50 מ"ל הממוקם מתחת לעמודת הבחירה כדי לאפשר להם לעבור.
6. בחירה חיובית מגנטית: פיפטה 6 מ"ל של PBS לתוך עמודת הבחירה. שטוף באופן מיידי את התאים המסומנים מגנטית על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך עמודת הבחירה כדי לקבל LLECs חיוביים ל-LYVE-1.
   הערה: המתן תמיד עד שמאגר עמודת הבחירה יתרוקן לפני שתמשיך לשלב הבא.

7. תרבות LLECs

1. צנטריפוגו את ה-LLECs החיוביים ל-LYVE-1 ב-300 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נטנט.
2. צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ² לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין עם⁵ מ"ל של מדיום תרבית.
3. לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, מנתקים את התאים עם 0.25% טריפסין ומבצעים מעבר תאים. נצלו את התאים לניסויים הבאים לאחר 2-3 מעברים.

8. ניתוח ציטומטרי זרימה

הערה: הניתוח הציטומטרי של Flow נערך בעקבות הליך¹⁵ שתואר קודם לכן.

1. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף את מאגר העצירה כדי לעצור את העיכול.
2. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות לחלוטין לשאוף את supernatant. השהה מחדש 1 x 10⁶ תאים ב 100 μL של PBS.
3. הוסף 1 μL של נוגדן LYVE-1. מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
4. השהה מחדש את התאים בכמות מתאימה של מאגר PBS לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה ותוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).

9. צביעה אימונופלואורסצנטית

הערה: הצביעה האימונופלואורסצנטית בוצעה בעקבות ההליך שתואר קודם לכן¹⁶.

1. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-PFA ושטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים.
2. החל את מאגר הבלוקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר הבלוקים מהכיסויים.
3. מוסיפים את נוגדן LYVE-1 במאגר הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.
4. מוסיפים נוגדן משני מתאים (ראו טבלת חומרים) בחיץ הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.
5. כתם נגדי עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.

תוצאות

מחקר זה מציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לקצירת תאי אנדותל לימפטיים (LLECs) מעכברים ולאחר מכן לביסוס התרבית הראשונית שלהם במבחנה. שלבי המפתח כוללים הכנת בקבוקים וציפוי פיברונקטין (fibronectin), דיסוציאציה של לפטומנינגים, השגת תרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי, וגרימת הרחבת LLECs עם VEGF-C. לאחר ...

Discussion

הפרוטוקול הקיים לקציר וגידול LLECs במבחנה לא דווח בעבר. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקציר וגידול LLECs מלפטומינינגים של עכברים.

בעוד פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ניתן לשחזור, ישנם מספר שיקולים מרכזיים. לדוגמה, צלוחיות T25 מצופות פיברונקטין מקדמות הידבקות של L...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C