Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas

Resumen

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.

Resumen

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) son una población celular intracraneal recientemente descubierta con una distribución única claramente distinta de las células endoteliales linfáticas periféricas. Su función celular y sus implicaciones clínicas siguen siendo en gran medida desconocidas. En consecuencia, la disponibilidad de un suministro de LLEC es esencial para llevar a cabo la investigación funcional in vitro. Sin embargo, actualmente no existe un protocolo para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro.

Este estudio cosechó con éxito los LLEC utilizando un protocolo de varios pasos, que incluyó el recubrimiento del matraz con fibronectina, la disección de las leptomeninges con la ayuda de un microscopio, la digestión enzimática de las leptomeninges para preparar una suspensión unicelular, la inducción de la expansión de los LLEC con el factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) y la selección de células positivas para el receptor hialurónico-1 del vaso linfático (LYVE-1) a través de la clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este proceso condujo finalmente al establecimiento de una cultura primaria. La pureza de los LLEC se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, con un nivel de pureza superior al 95%. Este protocolo de varios pasos ha demostrado reproducibilidad y viabilidad, lo que facilitará en gran medida la exploración de la función celular y las implicaciones clínicas de los LLECs.

Introducción

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) recientemente descubiertas forman una malla de células individuales dentro de las leptomeninges, exhibiendo un patrón de distribución distinto en comparación con las células endoteliales linfáticas periféricas ^1,2. Las funciones celulares y las implicaciones clínicas asociadas con los LLEC siguen siendo en gran medida un territorio inexplorado. Con el fin de allanar el camino para la investigación funcional de los LLECs, es imperativo establecer un modelo in vitro para su estudio. Por lo tanto, este estudio ha diseñado un protocolo integral para el aislamiento y el cultivo primario de los LLECs.

Los ratones son el modelo animal preferido debido a su idoneidad para la manipulación genética en la investigación de enfermedades. Estudios anteriores han aislado con éxito células endoteliales linfáticas de varios tejidos de ratón, incluidos los ganglios linfáticos³, el tejido mesentérico⁴, el tejido dérmico⁵, los linfáticos colectores⁶ y el tejido pulmonar⁷. Estos procedimientos de aislamiento se han basado principalmente en técnicas como la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) y la clasificación por citometría de flujo ^8,9,10. Además, los esfuerzos de investigación han llevado al establecimiento de líneas celulares aracnoideas de rata y líneas celulares capilares linfáticas de rata^11,12. A pesar de la existencia de técnicas de cultivo de explantes para leptomeninges¹³, existe una necesidad urgente de un protocolo estandarizado para el aislamiento y cultivo de LLECs. En consecuencia, este estudio ha cosechado y cultivado con éxito LLECs disociando meticulosamente leptomeninges bajo la guía de un microscopio y promoviendo la expansión de LLECs mediante el uso del factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C). El marcador distintivo de las células endoteliales linfáticas es el receptor hialurónico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1)¹⁴. Este protocolo de varios pasos aísla selectivamente los LLEC positivos para LYVE-1 mediante MACS y, posteriormente, verifica su pureza mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente.

Los pasos principales de este protocolo de varios pasos se pueden resumir de la siguiente manera: recubrimiento de matraz, disociación de leptomeninges, digestión enzimática de leptomeninges, expansión celular, selección celular magnética y posterior cultivo de LLECs. Finalmente, se confirma la pureza de los LLEC aislados mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente. El objetivo general de este estudio es presentar un protocolo reproducible de varios pasos para el aislamiento de LLECs de leptomeninges de ratón y su posterior cultivo in vitro . Este protocolo está preparado para facilitar en gran medida las investigaciones sobre las funciones celulares y las implicaciones clínicas de los LLECs.

Protocolo

Esta investigación recibió la aprobación del Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Todos los experimentos se adhirieron a las pautas establecidas para el cuidado de los animales. Se recolectaron células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC) de ratones machos C57Bl/6J de 6-8 semanas de edad y con un peso de entre 20-25 g. Estos ratones fueron adquiridos de la Universidad Médica de Kunming en Kunming, China. Todo el procedimiento experimental se llevó a cabo bajo estrictas condiciones estériles. Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario.

1. Preparación de reactivos e instrumentos

NOTA: Todos los pasos que involucren soluciones deben llevarse a cabo dentro de un gabinete de riesgo biológico de clase II.

1. Prepare el tampón de lavado mezclando solución salina tamponada con fosfato (PBS) con calcio y magnesio, suero fetal bovino (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina (P/S) al 1% (ver Tabla de materiales). Mantener este tampón frío a 4 °C. Es fundamental prepararlo fresco el día de su uso y desgasificar el tampón.
2. Prepare las enzimas digestivas combinando 10 ml de PBS (sin calcio ni magnesio) con 2 ml de tripsina al 0,25%, 1 ml de 20 mg/ml de papaína y 200 μl de colagenasa I (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Asegure el uso de alícuotas de volúmenes apropiados para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Almacenar estas alícuotas a -20 °C.
3. Prepare el medio de cultivo utilizando el kit de medio de crecimiento de células endoteliales disponible en el mercado, que incluye VEGF-C (100 ng/mL) y 1% de P/S (consulte la Tabla de materiales).
4. Prepare el tampón de detención complementando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de FBS para detener el proceso de digestión.
5. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles: estos instrumentos deben incluir tijeras, pinzas de punta dentada y pinzas de punta fina.

2. Recubrimiento del matraz

1. Recubra el matraz T25 con una solución de fibronectina de 100 μg/ml (véase la tabla de materiales) e incube durante la noche a 37 °C. Antes de usar, retire la solución de recubrimiento con una pipeta.
2. Lave el matraz tres veces con PBS, posteriormente aspire el PBS y deje que el matraz T25 se seque al aire.

3. Disociación de leptomeninges

NOTA: Utilice siempre tampones y soluciones preenfriados a 4 °C.

1. Anestesiar a los ratones con exceso de inhalación de isoflurano al 4% y luego sacrificarlos por decapitación rápida utilizando tijeras previamente limpias con etanol al 70%.
2. Incida con cuidado la piel a lo largo de la línea media, comenzando desde la abertura en la parte posterior del cráneo y extendiéndose hacia el área frontal.
3. Retire delicadamente el cráneo, levantándolo suavemente con las tijeras para evitar dañar las leptomeninges, asegurándose de obtener todo el cerebro, incluidas las leptomeninges.
4. Sumerge todo el cerebro en un tampón de lavado y enjuágalo suavemente para eliminar la sangre de la superficie.
5. Transfiera el cerebro a una placa de Petri estéril sin picar y extraiga las leptomeninges de la superficie del cerebro usando pinzas de punta fina bajo un microscopio.
6. Cortar el tejido de las leptomeninges en fragmentos con unas microtijeras estériles.

4. Digestión enzimática de Leptomeninges

1. Añadir 10 ml de la mezcla enzimática (paso 1.2) a los fragmentos e incubar a 37 °C durante 15 min. Agite suavemente para asegurarse de que los fragmentos se desprendan del fondo del tubo. Después, añade 10 ml de tampón de parada (paso 1.4) para detener la digestión.
2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
3. Agregue 10 ml de PBS frío y pase la mezcla a través de un colador de 70 μm a un tubo estéril de 50 ml para filtrar los grumos.

5. Expansión celular

1. Colocar 1 x 10 5 células por^cm2 en un matraz T25 recubierto de fibronectina (paso 2) con⁵ ml de medio de cultivo.
2. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h. Después, retire el medio para eliminar las células no adheridas.
3. Mantener el cultivo reemplazando el 50% del medio cada dos días. Repite este proceso dos o tres veces.

6. Selección de celdas magnéticas

NOTA: Trabaje rápidamente, mantenga la frialdad de las células y utilice soluciones preenfriadas para evitar el etiquetado de células no específicas.

1. Preparación de instrumentos y reactivos: conecte un separador magnético a un soporte separador magnético (consulte la tabla de materiales). Conecte una columna de selección al separador magnético y coloque un filtro de células de 70 μm encima de la columna de selección. Coloque un tubo de 50 ml debajo de la columna de selección para recoger el flujo.
2. Digestión enzimática: una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, aspirar el medio y enjuagar las células con PBS. Añadir tripsina al 0,25% para separar las células adherentes e incubar a 37 °C durante 5 min. Detenga la digestión agregando el tampón de parada. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
3. Incubación de anticuerpos: resuspender 1 x 10⁷ células totales en 100 μL de PBS y añadir 10 μL de anticuerpo LYVE-1 (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C.
   1. Girar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Enjuagar las células introduciendo 1 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire completamente el sobrenadante.
4. Etiquetado de microperlas: resuspender las células en 100 μL de PBS y añadir 20 μL de microperlas (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
   1. Girar las celdas a 300 x g durante 5 min y decantar el sobrenadante. Posteriormente, limpiar las células con 1 mL de PBS mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min. Finalmente, retire completamente el sobrenadante.
5. Exclusión magnética negativa: resuspender las células en 4 mL de PBS. Pase las células a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar los grumos. Prepare la columna de selección (consulte la Tabla de materiales) enjuagándola con 3 ml de PBS, luego aplique la suspensión de celdas en la columna de selección.
   1. Realice los pasos de lavado con 3 ml de PBS y recoja las células negativas de LYVE-1 en un tubo de 50 ml colocado debajo de la columna de selección para permitir que pasen.
6. Selección magnética positiva: pipetear 6 mL de PBS en la columna de selección. Elimine instantáneamente las celdas marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna de selección para obtener LLEC positivos para LYVE-1.
   NOTA: Espere siempre hasta que el depósito de la columna de selección esté vacío antes de continuar con el siguiente paso.

7. Cultura de los LLECs

1. Centrifugar los LLEC positivos LYVE-1 a 300 x g durante 5 minutos y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante.
2. Colocar 1 x 10⁵ células por^cm2 en un matraz T25 recubierto de fibronectina con 5 mL de medio de cultivo.
3. Mantenga el cultivo reemplazando el 50% del medio cada dos días. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, separe las células con tripsina al 0,25% y realice el paso celular. Utilice las celdas para experimentos posteriores después de 2-3 pasadas.

8. Análisis de citometría de flujo

NOTA: El análisis citométrico de flujo se realizó siguiendo el procedimiento¹⁵ descrito anteriormente.

1. Añadir tripsina al 0,25% para separar las células adherentes e incubar a 37 °C durante 5 min. Luego, agregue el tampón de parada para detener la digestión.
2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y aspirar completamente el sobrenadante. Resuspender 1 x 10⁶ células en 100 μL de PBS.
3. Añadir 1 μL de anticuerpo LYVE-1. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Vuelva a suspender las células en una cantidad adecuada de tampón PBS para su análisis mediante citometría de flujo y el software FlowJo (consulte la tabla de materiales).

9. Tinción inmunofluorescente

NOTA: La tinción inmunofluorescente se realizó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente¹⁶.

1. Lave las células con PBS tres veces. Fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el PFA y lave las células con PBS tres veces.
2. Aplique el tampón de bloque durante 1 h a temperatura ambiente. Retire el búfer de bloque de los cubreobjetos.
3. Agregue el anticuerpo LYVE-1 en el tampón de tinción a las células e incube en la oscuridad. Lave las celdas tres veces con PBS.
4. Agregue un anticuerpo secundario apropiado (ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a las células e incube en la oscuridad. Lave las celdas tres veces con PBS.
5. Contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las células ya están listas para la microscopía de inmunofluorescencia.

Resultados

Este estudio presenta un protocolo reproducible de varios pasos para la recolección de células endoteliales linfáticas (LLECs) de ratones y posteriormente establecer su cultivo primario in vitro. Los pasos clave incluyen la preparación del matraz y el recubrimiento de fibronectina, la disociación de leptomeninges, la obtención de una suspensión unicelular a través de la digestión enzimática y la inducción de la expansión de los LLEC con VEGF-C. A continuación, los LLEC positivos para LYVE-1 se aísl...

Discusión

El protocolo existente para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro no ha sido reportado previamente. Este estudio presenta un protocolo reproducible y multiprocedimiento para la recolección y el cultivo de LLEC de leptomeninges de ratón.

Si bien este protocolo de procedimientos múltiples es reproducible, hay varias consideraciones clave. Por ejemplo, los matraces T25 recubiertos de fibronectina promueven la adhesión de los LLEC y su función eliminando las células no adher...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C