Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas

Resumen

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.

Resumen

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) son una población celular intracraneal recientemente descubierta con una distribución única claramente distinta de las células endoteliales linfáticas periféricas. Su función celular y sus implicaciones clínicas siguen siendo en gran medida desconocidas. En consecuencia, la disponibilidad de un suministro de LLEC es esencial para llevar a cabo la investigación funcional in vitro. Sin embargo, actualmente no existe un protocolo para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro.

Este estudio cosechó con éxito los LLEC utilizando un protocolo de varios pasos, que incluyó el recubrimiento del matraz con fibronectina, la disección de las leptomeninges con la ayuda de un microscopio, la digestión enzimática de las leptomeninges para preparar una suspensión unicelular, la inducción de la expansión de los LLEC con el factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) y la selección de células positivas para el receptor hialurónico-1 del vaso linfático (LYVE-1) a través de la clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este proceso condujo finalmente al establecimiento de una cultura primaria. La pureza de los LLEC se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, con un nivel de pureza superior al 95%. Este protocolo de varios pasos ha demostrado reproducibilidad y viabilidad, lo que facilitará en gran medida la exploración de la función celular y las implicaciones clínicas de los LLECs.

Introducción

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) recientemente descubiertas forman una malla de células individuales dentro de las leptomeninges, exhibiendo un patrón de distribución distinto en comparación con las células endoteliales linfáticas periféricas ^1,2. Las funciones celulares y las implicaciones clínicas asociadas con los LLEC siguen siendo en gran medida un territorio inexplorado. Con el fin de allanar el camino para la investigación funcional de los LLECs, es imperativo establecer un modelo in vitro para su estudio. Por lo tanto, este estudio ha diseñado un....

Protocolo

Esta investigación recibió la aprobación del Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Todos los experimentos se adhirieron a las pautas establecidas para el cuidado de los animales. Se recolectaron células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC) de ratones machos C57Bl/6J de 6-8 semanas de edad y con un peso de entre 20-25 g. Estos ratones fueron adquiridos de la Universidad Médica de Kunming en Kunming, China. Todo el procedimiento experimental se llevó a cabo bajo estrictas condiciones estériles. Todos los pasos de centrifugación se realizan a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario.<....

Discusión

El protocolo existente para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro no ha sido reportado previamente. Este estudio presenta un protocolo reproducible y multiprocedimiento para la recolección y el cultivo de LLEC de leptomeninges de ratón.

Si bien este protocolo de procedimientos múltiples es reproducible, hay varias consideraciones clave. Por ejemplo, los matraces T25 recubiertos de fibronectina promueven la adhesión de los LLEC y su función eliminando las células no adher.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C