التصور في الجسم الحي للنشاط التلقائي في القشرة الحسية للفأر الوليدي بدقة خلية عصبية واحدة

Summary

تظهر المناطق الحسية الأولية في القشرة المخية الحديثة أنشطة عفوية فريدة أثناء النمو. توضح هذه المقالة كيفية تصور أنشطة الخلايا العصبية الفردية والمناطق الحسية الأولية لتحليل الأنشطة المتزامنة الخاصة بالمنطقة في الفئران الوليدية في الجسم الحي.

Abstract

يخضع دماغ الثدييات لتغيرات تنموية ديناميكية على المستويين الخلوي والدوري طوال فترات ما قبل الولادة وما بعدها. بعد اكتشاف العديد من الجينات التي تساهم في هذه التغيرات التنموية ، من المعروف الآن أن النشاط العصبي يعدل هذه العمليات بشكل كبير. في القشرة الدماغية النامية ، تظهر الخلايا العصبية أنماط نشاط متزامنة متخصصة في كل منطقة حسية أولية. تختلف هذه الأنماط بشكل ملحوظ عن تلك التي لوحظت في القشرة الناضجة ، مما يؤكد دورها في تنظيم العمليات التنموية الخاصة بالمنطقة. يمكن أن يؤدي نقص النشاط العصبي أثناء التطور إلى أمراض دماغية مختلفة. تسلط هذه النتائج الضوء على الحاجة إلى فحص الآليات التنظيمية الكامنة وراء أنماط النشاط في تطور الخلايا العصبية. تلخص هذه الورقة سلسلة من البروتوكولات لتصور المناطق الحسية الأولية والنشاط العصبي في الفئران الوليدية ، لتصوير نشاط الخلايا العصبية الفردية داخل الحقول الفرعية القشرية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي ، ولتحليل ارتباطات النشاط المتعلقة بالحقول الفرعية. نعرض نتائج تمثيلية للنشاط المتزامن الشبيه بالترقيع داخل البراميل الفردية في القشرة الحسية الجسدية. نناقش أيضا العديد من التطبيقات المحتملة وبعض القيود على هذا البروتوكول.

Introduction

تحتوي القشرة الدماغية على العديد من المناطق الحسية ذات الوظائف المتميزة. تتلقى المناطق مدخلات تنشأ من أعضائها الحسية المقابلة ، ويتم نقلها في الغالب عبر الحبل الشوكي أو جذع الدماغ ويتم نقلها عبر المهاد ^1,2. والجدير بالذكر أن الخلايا العصبية في كل منطقة حسية أولية تظهر نشاطا متزامنا بشكل فريد خلال مراحل النمو المبكرة ، والتي تنشأ أيضا من الأعضاء الحسية أو المراكز العصبية السفلية ، ولكنها تختلف اختلافا جوهريا عن الأنشطة التي لوحظت في القشرة^{الناضجة 3}.

في القوارض الوليدية ، على سبيل المثال ، تعرض المنطقة البصرية الأولية (V1) نشاط....

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للتجارب على في جامعة كوماموتو والمعهد الوطني لعلم الوراثة ووافقت عليها لجان التجارب على.

1. في التثقيب الكهربائي في الرحم (IUE)

1. رفيق ذكور الفئران TCA-RFP من خلفية ICR مع إناث الفئران من النوع البري ICR. راقب السدادة المهبلية للتحقق من التزاوج في الصباح الباكر من اليوم التالي. مراقبة البطن للتحقق من الحمل 2 أسابيع في وقت لاحق.
2. تحضير محلول البلازميد الذي يحتوي على 5 نانوغرام / ميكرولتر TRE-nCre ، 1 ميكروغرام / ميكرولتر CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE ، و 0.02٪ تريبان بلو في ddH₂O لتسمية الخلايا العصبية ....

النتائج

يوضح الشكل 1 النتائج التمثيلية لأنشطة الخلايا العصبية من الطبقة 4 في القشرة البرميلية لجرو P6 المتصور باستخدام البروتوكول الحالي. تم حساب متوسط الصور ثنائية الفوتون للقناة الخضراء (GCaMP) والقناة الحمراء (TCA-RFP) مؤقتا والموضحة في الشكل 1A. نظرا .......

Discussion

بالنظر إلى أن الأنشطة التلقائية تنشأ من العضو الحسي أو الجهاز العصبي السفلي وتنتقل إلى المنطقة الحسية الأولية من خلال مسار مكافئ لمسار الجهاز العصبي الناضج³ ، فمن الأهمية بمكان تحديد المنطقة الحسية الأولية وموقع الخلايا العصبية المصورة داخل المنطقة. في هذ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR