在单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的体内可视化

摘要

新皮层的初级感觉区域在发育过程中表现出独特的自发活动。本文介绍了如何可视化单个神经元活动和初级感觉区域，以分析 体内新生小鼠的面积特异性同步活动。

摘要

哺乳动物大脑在整个产前和产后期间在细胞和回路水平上经历动态发育变化。在发现许多导致这些发育变化的基因之后，现在已知神经元活动也显着调节这些过程。在发育中的大脑皮层中，神经元表现出特定于每个主要感觉区域的同步活动模式。这些模式与在成熟皮层中观察到的模式明显不同，强调了它们在调节特定区域发育过程中的作用。发育过程中神经元活动的缺陷会导致各种脑部疾病。这些发现强调了检查神经元发育中活动模式背后的调节机制的必要性。本文总结了一系列协议，用于可视化新生小鼠的初级感觉区域和神经元活动，在 体内使用双光子显微镜对皮层子场内单个神经元的活动进行成像，并分析与子场相关的活动相关性。我们展示了体感皮层中单个桶内拼凑状同步活动的代表性结果。我们还讨论了该协议的各种潜在应用和一些局限性。

引言

大脑皮层包含几个具有不同功能的感觉区域。这些区域接收来自其相应感觉器官的输入，主要通过脊髓或脑干传递并通过丘脑传递 ^1,2。值得注意的是，每个初级感觉区的神经元在早期发育阶段表现出独特的同步活动，这些活动也起源于感觉器官或下神经中枢，但与在成熟皮层中观察到的活动本质上不同³。

例如，在新生啮齿动物中，初级视觉区域 （V1） 显示波状活动，该活动起源于视网膜（视网膜波）并通过整个视觉通路传播，同时保留视网膜⁴。初级听觉区域 （A1） 表现出同步活动，组织在与成熟大脑中的等频带相对应的带状子区域中。这种活动来自耳蜗的内毛细胞 ^5,6。初级体感区 （S1） 的桶状皮层表现出一种拼凑状的活动模式，其中单个桶内的第 4 层神经元，即对单个胡须做出反应的神经元，被同步激活⁷。虽然提出起源于三叉神经节，但活动的来源仍然未知⁷。因此，新生儿活动模式在每个主要感觉区域和区域内子领域内都是专门的。神经元活动和....

研究方案

所有实验均按照熊本大学和国立遗传学研究所的动物实验指南进行，并得到动物实验委员会的批准。

1. 宫内 电穿孔 （IUE）

1. 将 ICR 背景的雄性 TCA-RFP 小鼠与雌性野生型 ICR 小鼠交配。观察阴道塞，检查第二天清晨的交配情况。观察腹部，2 周后检查是否怀孕。
2. 在 ddH₂O 中制备含有 5 ng/μL TRE-nCre、1 μg/μL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE 和 0.02% 台盼蓝的质粒溶液，以使用 Supernova 系统通过 GCaMP 稀疏标记神经元⁸。
3. 制备含有 0.5 mg/mL 卡洛芬和 0.01 mg/mL 丁丙诺啡的镇痛溶液。避光保存，并在室温下保存。
4. 在胚胎日 （E）14，按如下方式进行 IUE。IUE 方法与以前的报告^9、10、11 基本相同。
   1. 用 70% 乙醇或戊二醛溶液擦拭实验室工作台。通过高压灭菌对所有手术器械进行消毒。....

讨论

鉴于自发活动从感觉器官或下神经系统出现，并通过相当于成熟神经系统的通路传播到初级感觉区域³，因此定义初级感觉区域和该区域内成像神经元的位置至关重要。在该协议中，我们通过使用可视化丘脑皮质轴突的转基因小鼠和稀疏表达 GCaMP 的 Supernova 系统来满足这一要求⁸。这些技术能够分析每个感觉区域内以及区域内子领域的活?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR