Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi

Özet

Neokorteksteki birincil duyusal alanlar, gelişim sırasında benzersiz spontan aktiviteler sergiler. Bu makale, yenidoğan farelerde alana özgü senkron aktiviteleri in vivo olarak analiz etmek için bireysel nöron aktivitelerinin ve birincil duyusal alanların nasıl görselleştirileceğini açıklamaktadır.

Özet

Memeli beyni, doğum öncesi ve doğum sonrası dönemler boyunca hem hücresel hem de devre düzeyinde dinamik gelişimsel değişikliklere uğrar. Bu gelişimsel değişikliklere katkıda bulunan çok sayıda genin keşfedilmesinin ardından, nöronal aktivitenin de bu süreçleri önemli ölçüde modüle ettiği bilinmektedir. Gelişmekte olan serebral kortekste, nöronlar, her bir birincil duyusal alana özelleşmiş senkronize aktivite modelleri sergiler. Bu kalıplar, olgun kortekste gözlemlenenlerden belirgin şekilde farklıdır ve bölgeye özgü gelişimsel süreçleri düzenlemedeki rollerini vurgular. Gelişim sırasında nöronal aktivitedeki eksiklikler çeşitli beyin hastalıklarına yol açabilir. Bu bulgular, nöronal gelişimdeki aktivite modellerinin altında yatan düzenleyici mekanizmaların incelenmesi ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu makale, yenidoğan farelerde birincil duyusal alanları ve nöronal aktiviteyi görselleştirmek, in vivo olarak iki foton mikroskobu kullanarak kortikal alt alanlardaki bireysel nöronların aktivitesini görüntülemek ve alt alanla ilgili aktivite korelasyonlarını analiz etmek için bir dizi protokolü özetlemektedir. Somatosensoriyel korteksteki bireysel variller içindeki yama işi benzeri senkron aktivitenin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Ayrıca çeşitli potansiyel uygulamaları ve bu protokolün bazı sınırlamalarını da tartışıyoruz.

Giriş

Serebral korteks, farklı işlevlere sahip birkaç duyusal alan içerir. Alanlar, çoğunlukla omurilik veya beyin sapı yoluyla iletilen ve talamus ^1,2 yoluyla iletilen karşılık gelen duyu organlarından kaynaklanan girdileri alır. Özellikle, her bir birincil duyusal alandaki nöronlar, aynı zamanda duyusal organlardan veya alt sinir merkezlerinden kaynaklanan, ancak esasen olgun korteks^3'te gözlemlenen aktivitelerden farklı olan erken gelişim aşamalarında benzersiz bir şekilde senkronize aktivite sergiler.

Örneğin yenidoğan kemirgen....

Protokol

Tüm deneyler, Kumamoto Üniversitesi ve Ulusal Genetik Enstitüsü'nün hayvan deneyleri yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve hayvan deneyleri komiteleri tarafından onaylandı.

1. In utero elektroporasyon (IUE)

1. ICR arka planına sahip erkek TCA-RFP farelerini dişi vahşi tip ICR fareleri ile eşleştirin. Ertesi gün sabahın erken saatlerinde çiftleşmeyi kontrol etmek için vajinal tıkacı gözlemleyin. 2 hafta sonra hamileliği kontrol etmek için karnı gözlemleyin.
2. Süpernova^{sistemini 8} kullanarak nöronları GCaMP ile seyrek olarak etiketlemek....

Tartışmalar

Spontan aktivitelerin duyu organından veya alt sinir sisteminden çıktığı ve olgun bir sinir sistemininkine eşdeğer bir yol yoluyla birincil duyu alanına^{gittiği göz} önüne alındığında 3, birincil duyu alanını ve görüntülenen nöronların alan içindeki yerini tanımlamak çok önemlidir. Bu protokolde, talamokortikal aksonları görselleştiren transgenik fareler ve GCaMP'yi seyrek^{olarak ifade} eden Süpernova sistemi 8 k.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR