In vivo Visualisierung der spontanen Aktivität im sensorischen Kortex von Neonatalen Mäusen mit einer Auflösung von einzelnen Neuronen

Zusammenfassung

Primäre sensorische Areale im Neokortex zeigen während der Entwicklung einzigartige spontane Aktivitäten. In diesem Artikel wird beschrieben, wie einzelne Neuronenaktivitäten und primäre sensorische Areale visualisiert werden können, um bereichsspezifische synchrone Aktivitäten bei neugeborenen Mäusen in vivo zu analysieren.

Zusammenfassung

Das Gehirn von Säugetieren durchläuft während der pränatalen und postnatalen Periode dynamische Entwicklungsveränderungen sowohl auf zellulärer als auch auf Schaltkreisebene. Nach der Entdeckung zahlreicher Gene, die zu diesen Entwicklungsveränderungen beitragen, ist nun bekannt, dass auch die neuronale Aktivität diese Prozesse wesentlich moduliert. In der sich entwickelnden Großhirnrinde weisen Neuronen synchronisierte Aktivitätsmuster auf, die auf jeden primären sensorischen Bereich spezialisiert sind. Diese Muster unterscheiden sich deutlich von denen, die in der reifen Hirnrinde beobachtet werden, was ihre Rolle bei der Regulierung bereichsspezifischer Entwicklungsprozesse unterstreicht. Defizite in der neuronalen Aktivität während der Entwicklung können zu verschiedenen Erkrankungen des Gehirns führen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Regulationsmechanismen zu untersuchen, die den Aktivitätsmustern in der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen. Diese Arbeit fasst eine Reihe von Protokollen zusammen, um primäre sensorische Areale und neuronale Aktivität bei neonatalen Mäusen zu visualisieren, die Aktivität einzelner Neuronen innerhalb der kortikalen Teilfelder mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivo abzubilden und teilfeldbezogene Aktivitätskorrelationen zu analysieren. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse der Patchwork-artigen synchronen Aktivität innerhalb einzelner Fässer im somatosensorischen Kortex. Wir diskutieren auch verschiedene mögliche Anwendungen und einige Einschränkungen dieses Protokolls.

Einleitung

Die Großhirnrinde umfasst mehrere sensorische Areale mit unterschiedlichen Funktionen. Die Areale erhalten Eingaben, die von den entsprechenden Sinnesorganen ausgehen und meist über das Rückenmark oder den Hirnstamm weitergeleitet und über den Thalamus ^1,2 weitergeleitet werden. Bemerkenswert ist, dass Neuronen in jedem primären sensorischen Bereich während der frühen Entwicklungsstadien eine einzigartig synchronisierte Aktivität aufweisen, die ebenfalls von den Sinnesorganen oder den unteren Nervenzentren ausgeht, sich aber im Wesentlichen von den Aktivitäten unterscheidet, d....

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche der Universität Kumamoto und des Nationalen Instituts für Genetik durchgeführt und von den Tierversuchskommissionen genehmigt.

1. In-utero-Elektroporation (IUE)

1. Verpaaren Sie männliche TCA-RFP-Mäuse mit ICR-Hintergrund mit weiblichen Wildtyp-ICR-Mäusen. Beobachten Sie den Vaginalpfropfen, um am frühen Morgen des nächsten Tages nach Paarung zu suchen. Beobachten Sie den Bauch, um 2 Wochen später nach einer Schwangerschaft zu suchen.
2. Bereiten Sie eine Plasmidlösung her, die 5 ng/μl TRE-nC....

Diskussion

Angesichts der Tatsache, dass die spontanen Aktivitäten aus dem Sinnesorgan oder dem unteren Nervensystem hervorgehen und über einen Weg, der dem eines reifen Nervensystems³ entspricht, zum primären sensorischen Bereich gelangen, ist es entscheidend, den primären sensorischen Bereich und die Position der abgebildeten Neuronen innerhalb des Bereichs zu definieren. In diesem Protokoll haben wir diese Anforderung erfüllt, indem wir transgene Mäuse eingesetzt ha.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR