新生児マウス感覚皮質における自発的活動の単一ニューロン分解能でのin vivo可視化

要約

新皮質の主要な感覚野は、発達中に独特の自発的な活動を示します。この記事では、 in vivoで新生児マウスの領域特異的な同期活動を解析するために、個々のニューロン活動と一次感覚野を可視化する方法について説明します。

要約

哺乳類の脳は、出生前と出生後の期間を通じて、細胞レベルと回路レベルの両方でダイナミックな発達変化を経験します。これらの発生変化に寄与する多数の遺伝子の発見に続いて、現在では、ニューロンの活動もこれらのプロセスを実質的に調節することが知られています。発達中の大脳皮質では、ニューロンは各一次感覚領域に特化した同期した活動パターンを示します。これらのパターンは、成熟した皮質で観察されるパターンとは著しく異なり、領域固有の発達過程を調節する役割を強調しています。発達中のニューロン活動の欠損は、さまざまな脳疾患につながる可能性があります。これらの知見は、ニューロン発生における活動パターンの根底にある調節機構を調べる必要性を浮き彫りにしている。この論文は、新生児マウスの一次感覚野とニューロン活動を視覚化し、 in vivoで2光子顕微鏡を使用して皮質サブフィールド内の個々のニューロンの活動を画像化し、サブフィールド関連の活動相関を分析するための一連のプロトコルをまとめたものです。体性感覚皮質の個々のバレル内でのパッチワークのような同期活動の代表的な結果を示します。また、このプロトコルのさまざまな潜在的なアプリケーションといくつかの制限についても説明します。

概要

大脳皮質には、異なる機能を持ついくつかの感覚領域が含まれています。領域は、対応する感覚器官から入力を受け取り、主に脊髄または脳幹を介して伝達され、視床^1,2を介して中継されます。特に、各一次感覚野のニューロンは、発達初期に独自の同期活動を示し、これも感覚器官または下部神経中枢に由来しますが、成熟した皮質^で観察される活動とは本質的に異なります3。

例えば、新生児のげっ歯類では、一次視覚野(V1)は波状の活動を示し、これは網膜(網膜波)に由来し、網膜^{トピーを保存し}ながら視覚経路全体を通じて伝播する4。一次聴覚野(A1)は、成熟した脳の等周波帯に対応する帯状のサブ領域に編成された同期活動を示します。この活性は、蝸牛の内側の有毛細胞^5,6から発せられます。一次体性感覚野(S1)の樽皮質は、個々の樽内の第4層ニューロン、すなわち個々のヒゲに応答するニューロンが同期^{的に活性化される}パッチワークのような活動パターンを示している7。三叉神経節に由来する....

プロトコル

すべての実験は、熊本大学と国立遺伝学研究所の動物実験ガイドラインに従って行われ、動物実験委員会によって承認されました。

1. 子宮内 エレクトロポレーション(IUE)

1. ICRバックグラウンドの雄TCA-RFPマウスと雌の野生型ICRマウスを交配します。膣栓を観察して、翌日の早朝に交尾を確認します。2週間後に腹部を観察して妊娠を確認します。
2. 5 ng/μL TRE-nCre、1 μg/μL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE、およびddH₂O中の0.02 % Trypan Blueを含むプラスミド溶液を調製し、Supernovaシステム⁸を使用してGCaMPでニューロンをスパースに標識します。
3. 0.5 mg / mLのカルプロフェンと0.01 mg / mLのブプレノルフィンを含む鎮痛液を準備します。.光から保護し、室温で保管してください。
4. 胚の日(E)14に、次のようにIUEを行います。IUE法は、以前の報告^9,10,11

ディスカッション

自発的な活動が感覚器官または下部神経系から発生し、成熟した神経系³と同等の経路を通じて一次感覚領域に移動することを考えると、一次感覚領域とその領域内の画像化されたニューロンの位置を定義することが重要です。このプロトコルでは、視床皮質軸索を可視化するトランスジェニックマウスと、GCaMPをまばらに発現するSupernovaシステム8?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR