Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Resumo

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Resumo

O cérebro dos mamíferos sofre mudanças dinâmicas de desenvolvimento nos níveis celular e de circuito durante os períodos pré-natal e pós-natal. Após a descoberta de vários genes que contribuem para essas mudanças no desenvolvimento, sabe-se agora que a atividade neuronal também modula substancialmente esses processos. No córtex cerebral em desenvolvimento, os neurônios exibem padrões de atividade sincronizados que são especializados em cada área sensorial primária. Esses padrões diferem marcadamente daqueles observados no córtex maduro, enfatizando seu papel na regulação dos processos de desenvolvimento específicos da área. Deficiências na atividade neuronal durante o desenvolvimento podem levar a várias doenças cerebrais. Essas descobertas destacam a necessidade de examinar os mecanismos regulatórios subjacentes aos padrões de atividade no desenvolvimento neuronal. Este artigo resume uma série de protocolos para visualizar áreas sensoriais primárias e atividade neuronal em camundongos neonatais, para obter imagens da atividade de neurônios individuais dentro dos subcampos corticais usando microscopia de dois fótons in vivo e para analisar correlações de atividade relacionadas ao subcampo. Mostramos resultados representativos da atividade síncrona semelhante a uma colcha de retalhos dentro de barris individuais no córtex somatossensorial. Também discutimos várias aplicações potenciais e algumas limitações deste protocolo.

Introdução

O córtex cerebral contém várias áreas sensoriais com funções distintas. As áreas recebem informações provenientes de seus órgãos sensoriais correspondentes, principalmente transmitidas pela medula espinhal ou tronco encefálico e retransmitidas pelo tálamo ^1,2. Notavelmente, os neurônios em cada área sensorial primária exibem atividade sincronizada de forma única durante os estágios iniciais de desenvolvimento, que também se originam de órgãos sensoriais ou dos centros nervosos inferiores, mas diferem essencialmente das atividades observadas no córtex maduro^3<....

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes para experimentação animal da Universidade de Kumamoto e do Instituto Nacional de Genética e aprovados pelos comitês de experimentação animal.

1. Eletroporação in utero (IUE)

1. Acasalar camundongos TCA-RFP machos de fundo ICR com camundongos ICR fêmeas do tipo selvagem. Observe o tampão vaginal para verificar se há acasalamento na manhã do dia seguinte. Observe o abdômen para verificar se há gravidez 2 semanas depois.
2. Preparar uma solução plasmidial contendo 5 ng/μL de TRE-nCre, 1 μg/μL de CAG-loxP....

Discussão

Dado que as atividades espontâneas emergem do órgão sensorial ou do sistema nervoso inferior e viajam para a área sensorial primária por meio de uma via equivalente à de um sistema nervoso maduro³, é crucial definir a área sensorial primária e a localização dos neurônios imageados dentro da área. Neste protocolo, abordamos esse requisito empregando camundongos transgênicos que visualizam axônios tálamo-corticais e o sistema Supernova que expressa G.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR