تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي

Summary

البكتيريا (العاثيات) ، الفيروسات التي تصيب البكتيريا ، هي جزء لا يتجزأ من ميكروبيوم الأمعاء. على الرغم من أن هؤلاء السكان التكافليين يقودون اللياقة البكتيرية وديناميكيات السكان ، إلا أنه لا يفهم سوى القليل عن كيفية تأثيرها على توازن الأمعاء والمرض. يدرس هذا البروتوكول عاثيات T4 المعزولة داخل نموذج فأر ، قابلة للتكيف مع أزواج العاثيات البكتيرية الأخرى.

Abstract

البكتيريا (العاثيات) هي فيروسات تصيب البكتيريا بخصوصية على مستوى الأنواع والسلالة، وهي أكثر الكيانات البيولوجية وفرة في جميع النظم الإيكولوجية المعروفة. داخل المجتمعات البكتيرية ، مثل تلك الموجودة في ميكروبات الأمعاء ، فإن العاثيات متورطة في تنظيم ديناميكيات مجموعة الميكروبات ودفع التطور البكتيري. كان هناك اهتمام متجدد بأبحاث العاثيات في العقد الماضي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قدرات القتل الخاصة بالمضيف للعاثيات المحللة ، والتي توفر أداة واعدة لمواجهة التهديد المتزايد للبكتيريا المقاومة لمضادات الميكروبات. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة التي تثبت أن العاثيات تلتصق بالمخاط المعوي إلى أنها قد يكون لها دور وقائي في منع الغزو البكتيري للظهارة الأساسية. الأهم من ذلك ، مثل الميكروبات البكتيرية ، ارتبطت البلعوم المعطلة بنتائج متفاقمة في أمراض مثل مرض التهاب الأمعاء. أظهرت الدراسات السابقة أن العاثيات يمكن أن تعدل ميكروبيوم والبشر من خلال عمليات زرع الترشيح البرازي ، مما يفيد صحة المضيف. مع هذه الموجة الأخيرة من الأبحاث تأتي ضرورة إنشاء وتوحيد بروتوكولات لدراسة العاثيات في سياق ميكروبيوم الأمعاء. يوفر هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات لدراسة عاثيات T4 المعزولة ومضيفها البكتيري ، الإشريكية القولونية ، في سياق الجهاز الهضمي للفئران. توضح الطرق الموضحة هنا كيفية البدء من تحلل العاثيات ، وإدارتها للفئران وتقييم التأثيرات على مستويات المضيف البكتيري والعاثيات. يمكن تعديل هذا البروتوكول وتطبيقه على أزواج العاثيات البكتيرية الأخرى ويوفر نقطة انطلاق لدراسة ديناميكيات العاثية المضيفة في الجسم الحي.

Introduction

البكتيريا ، أو العاثيات ، هي فيروسات تصيب وتقتل البكتيريا بالأنواع وخصوصية مستوى السلالة¹. تلعب العاثيات أدوارا مهمة داخل المجتمعات البكتيرية المعقدة مثل ميكروبيوتا الأمعاء ، حيث تورطت في تنظيم ديناميكيات السكان وقيادة اللياقة البكتيرية². طوال العقد الماضي ، كان هناك اهتمام متجدد بأبحاث العاثيات بسبب ظهور مسببات الأمراض المقاومة لمضادات الميكروبات³ ، وإمكانية العلاج بالعاثيات كاستراتيجية علاج بديلة. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام كوكتيلات العاثية lytic عن طريق الوريد مع بعض النجاح في الالتهابات الإنتانية البكتيرية الخطيرة المقاومة للمضادات الحيوية في البشر ^3,4

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية في جامعة كولومبيا البريطانية والبروتوكولات المعتمدة من لجنة السلامة البيولوجية (A23-0113 ، B19-0038). تم إيواء الفئران في جامعة كولومبيا البريطانية في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض في مركز نمذجة الأمراض. تم تربية الفئران C57BL / 6 داخل المنشأة في عازل فيلم مرن معقم ، مزود بنظام غذائي معقم للفأر ، وماء ، وفراش ، ومواد تعشيش. تم الحفاظ على الفئران في دورة 12 ساعة ليلا ونهارا. تم مطابقة عمر فئران التجارب ، ذكورا وإناثا ، في كل تجربة ، تتراوح بين 6 إلى 12 أسبوعا من العمر وتزن 15-30 جم لجميع التجارب.

1. إعداد تحلل العاثيات والمركبات للتزويف الفموي في الفئران

النتائج

للتحقيق في التفاعلات بين T4 phage / E. coli dyad في أمعاء الفئران ، تم تحضير وتنظيف وتنقية العاثية T4 ومحللات المركبات (الشكل 1 أ). تم معايرة محللات العاثية T4 بواسطة مقايسة البلاك وتخفيفها إلى 2 × 10⁷ pfu / mL (2 × 10⁶ pfu / mouse) في المخزن المؤقت SM. كما تم معايرة محللات المركبات لتأ?.......

Discussion

تمثل دراسة العاثيات في الميكروبيوم تحديا كبيرا مقارنة بنظيراتها البكتيرية. على وجه التحديد ، لا تحتوي العاثيات على علامة تطورية محفوظة مشتركة بين جميع العاثيات المشابهة للوحدات الفرعية الريبوسومية 16S و 18S التي تسمح بسهولة تسلسل وتحديد الأنواع بدائية النواة وحقيقية النواة ، على التوالي

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100