小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用：研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型

摘要

噬菌体（噬菌体）是感染细菌的病毒，是肠道微生物组的一个组成部分。尽管这些共生居民驱动细菌适应性和种群动态，但人们对它们如何影响肠道稳态和疾病知之甚少。该方案研究小鼠模型中分离的T4噬菌体，适应其他噬菌体 - 细菌对。

摘要

噬菌体（噬菌体）是以物种和菌株水平特异性感染细菌的病毒，是所有已知生态系统中最丰富的生物实体。在细菌群落中，例如在肠道微生物群中发现的细菌群落中，噬菌体与调节微生物群群动态和驱动细菌进化有关。在过去十年中，人们对噬菌体研究重新产生了兴趣，部分原因是裂解噬菌体的宿主特异性杀伤能力，这为对抗日益增长的抗菌素耐药细菌威胁提供了一种有前途的工具。此外，最近的研究表明噬菌体粘附在肠道粘液上，这表明它们可能在防止细菌入侵底层上皮细胞方面具有保护作用。重要的是，与细菌微生物组一样，被破坏的相体组与炎症性肠病等疾病的恶化结果有关。先前的研究表明，噬菌体可以通过粪便滤液移植调节动物和人类的微生物组，有益于宿主的健康。随着最近的研究浪潮，有必要建立和标准化在肠道微生物组背景下研究噬菌体的方案。 该协议提供了一套程序，用于在小鼠胃肠道的背景下研究分离的T4噬菌体及其细菌宿主大肠杆菌。这里描述的方法概述了如何从噬菌体裂解物开始，将其施用于小鼠并评估对细菌宿主和噬菌体水平的影响。该方案可以修改并应用于其他噬菌体 - 细菌对，并为研究体内宿主 - 噬菌体动力学提供了起点。

引言

噬菌体或噬菌体是感染和杀死细菌的病毒，具有物种和菌株水平的特异性¹。噬菌体在复杂的细菌群落（如肠道微生物群）中发挥着重要作用，它们与调节种群动态和驱动细菌适应性有关²。在过去十年中，由于抗菌素耐药病原体³的兴起，以及噬菌体疗法作为替代治疗策略的潜力，人们对噬菌体研究重新产生了兴趣。近年来，裂解噬菌体混合物已静脉注射，在人类严重的抗生素耐药细菌性败血症感染中取得了一些成功 ^3,4。口服噬菌体疗法也被提议作为抗生素的潜在替代品，以治疗肠道感染和炎症。此外，噬菌体还与粪便滤液移植 （FFT） 的成功有关，FFT 是经过过滤以去除细菌的粪便微生物群制剂，用于治疗复发性艰难梭菌感染 （rCDI）^5,6、炎症性肠病 （IBD）^7,8 和早产猪坏死性小肠结肠炎⁹.鉴于这些结果，重要的是要考虑噬菌体与肠道微生物群以及噬菌体与哺乳动物宿主之间的相互作用，因为将新型噬菌体添加到预先存在的群落中可能....

研究方案

所有实验均按照UBC动物护理委员会和生物安全委员会批准的协议（A23-0113，B19-0038）制定的指南进行。小鼠被安置在不列颠哥伦比亚大学疾病建模中心的无病原体条件下。C57BL/6小鼠在无菌柔性薄膜隔离器中饲养，提供无菌小鼠饮食，水，垫料和筑巢材料。小鼠维持在12小时的昼夜循环中。实验小鼠，包括雄性和雌性，在每个实验中年龄匹配，年龄在6至12周之间，所有实验的体重为15-30克。

1.噬菌体和载体裂解物的制备，用于口服灌胃到小鼠体内

1. 噬菌体纯化和原液生成
   注意：在这项研究中，T4噬菌体通过使用单琼脂层方法接种到细菌草坪上来生长和滴度，如下所述。双琼脂层方法前面已经描述过^25,27并且也可以以类似的功效使用。该方案选择了单琼脂层方法，因为它提供了更好的斑块可见性²⁸.
   1. 在无菌聚苯乙烯或玻璃培养管（带盖）中的 5 mL 无菌 LB 培养基中培养 大肠杆 菌。在37°C下孵育管，以200rpm振荡过夜，直到达到固定相。
   2. 在补充前，用0.5%琼脂高压灭菌LB并冷却至50°C或以下（同时保持液体），在玻璃培养基瓶中制备软琼脂。准备足够的软琼脂，每块板 15 mL。

讨论

与细菌对应物相比，微生物组中噬菌体的研究提出了重大挑战。具体来说，噬菌体不包含所有噬菌体共有的保守系统发育标记，类似于 16S 和 18S 核糖体亚基，分别允许对原核和真核物种进行测序和鉴定⁴²。然而，随着下一代测序方法的进步，包括增加读长、通量和降低成本，噬菌体基因组数据库的快速扩展42,43,44。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100