쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

요약

박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.

초록

박테리오파지(파지)는 종 및 균주 수준의 특이성을 가진 박테리아를 감염시키는 바이러스이며 알려진 모든 생태계에서 가장 풍부한 생물학적 개체입니다. 장내 미생물군에서 발견되는 것과 같은 박테리아 군집 내에서 파지는 미생물군 개체군 역학을 조절하고 박테리아 진화를 주도하는 데 관여합니다. 지난 10년 동안 파지 연구에 대한 관심이 다시 높아졌는데, 이는 부분적으로 항생제 내성 박테리아의 증가하는 위협에 대응할 수 있는 유망한 도구를 제공하는 용해 파지의 숙주 특이적 살상 능력 때문입니다. 또한, 파지가 장 점액에 달라붙는다는 것을 입증한 최근 연구는 파지가 박테리아가 하부 상피로 침입하는 것을 방지하는 보호 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 박테리아 마이크로바이옴과 마찬가지로 파괴된 파지오메는 염증성 장 질환과 같은 질병의 악화된 결과와 관련이 있다는 것입니다. 이전 연구에서는 파지가 분변 여과액 이식을 통해 동물과 인간의 마이크로바이옴을 조절하여 숙주의 건강에 도움이 될 수 있음을 입증했습니다. 이러한 최근의 연구의 물결로 인해 장내 마이크로바이옴의 맥락에서 파지를 연구하기 위한 프로토콜을 수립하고 표준화해야 할 필요성이 대두되고 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 위장관의 맥락에서 분리된 T4 파지와 박테리아 숙주인 대장균을 연구하기 위한 일련의 절차를 제공합니다. 여기에 설명된 방법은 파지 용해물에서 시작하여 마우스에 투여하고 박테리아 숙주 및 파지 수준에 대한 영향을 평가하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 변형되어 다른 파지-박테리아 쌍에 적용될 수 있으며 생체 내에서 숙주-파지 역학을 연구하기 위한 출발점을 제공합니다.

서문

박테리오파지(Bacteriophage) 또는 파지(phage)는 종 및 균주 수준 특이성을 가진 박테리아를 감염시키고 죽이는 바이러스입니다¹. 파지는 장내 미생물군(gut microbiota)과 같은 복잡한 박테리아 군집 내에서 중요한 역할을 하며, 개체군 역학을 조절하고 박테리아 적합성을 촉진하는 데 관여한다². 지난 10년 동안 항생제 내성 병원체³의 증가와 대체 치료 전략으로서의 파지 요법의 잠재력으로 인해 파지 연구에 대한 관심이 다시 높아졌습니다. 최근 몇 년 동안 용해 파지 칵테일은 인간의 심각한 항생제 내성 세균 패혈증 감염에 어느 정도 성공을 거두면서 정맥 주사로 사용되었습니다 ^3,4. 경구 파지 요법은 또한 장 감염 및 염증을 치료하기 위한 항생제의 잠재적인 대안으로 제안되었습니다. 또한, 파지는 박테리아를 제거하기 위해 여과된 분변 미생물군 제제인 분변 여과물 이식(FFT)의 성공과 관련이 있으며, 재발성 클로스트리디오이데스 디피실 감염(rCDI)^5,6

프로토콜

모든 실험은 UBC 동물 관리 위원회 및 생물 안전 위원회가 승인한 프로토콜(A23-0113, B19-0038)에 의해 설정된 지침에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 브리티시 컬럼비아 대학의 질병 모델링 센터(Center for Disease Modelling)에서 병원체가 없는 조건에서 수용되었습니다. C57BL/6 마우스는 멸균 마우스 식단, 물, 침구 및 둥지 재료가 제공된 멸균 플렉시블 필름 아이솔레이터에서 시설 내에서 사육되었습니다. 마우스는 12시간 주야간 주기로 유지하였다. 실험용 마우스(수컷과 암컷 모두)는 각 실험 내에서 연령이 일치되었으며, 생후 6주에서 12주 사이이고 모든 실험에서 체중은 15-30g이었습니다.

1. 마우스로의 구강 개변을 위한 파지 및 차량 용해물의 제조

1. 파지 정제 및 스톡 생성
   참고: 이 연구에서 T4 파지는 아래에 설명된 단일 한천 층 방법을 사용하여 박테리아 잔디밭에 도금하여 성장하고 적정됩니다. 이중 한천층 방법은 이전에 설명했습니다^25,27또한 유사한 효능으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 단일 한천층 분....

토론

마이크로바이옴의 파지 연구는 박테리아 파지에 비해 상당한 도전 과제를 제시합니다. 특히, 파지는 원핵생물 및 진핵생물 종의 시퀀싱 및 식별을 용이하게 하는 16S 및 18S 리보솜 소단위체와 유사한 모든 파지에 공통적인 보존된 계통발생학적 마커를 각각 포함하지 않는다(⁴²). 그러나 판독 길이, 처리량 증가 및 비용 절감을 포함한 차세대 염기서열 분석 접근법의 발전으로 박테.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100