T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Zusammenfassung

Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

Zusammenfassung

Bakteriophagen (Phagen) sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten in allen bekannten Ökosystemen sind. Innerhalb von Bakteriengemeinschaften, wie sie in der Darmmikrobiota vorkommen, sind Phagen an der Regulierung der Populationsdynamik der Mikrobiota und der Förderung der bakteriellen Evolution beteiligt. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung wieder gestiegen, zum Teil aufgrund der wirtsspezifischen Abtötungsfähigkeiten lytischer Phagen, die ein vielversprechendes Instrument bieten, um der zunehmenden Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien entgegenzuwirken. Darüber hinaus deuten neuere Studien, die zeigen, dass Phagen am Darmschleim haften, darauf hin, dass sie eine schützende Rolle bei der Verhinderung des bakteriellen Eindringens in das darunter liegende Epithel spielen könnten. Wichtig ist, dass gestörte Phageome wie bakterielle Mikrobiome mit verschlechterten Ergebnissen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Phagen das Mikrobiom von Tieren und Menschen durch Stuhlfiltrattransplantationen modulieren können, was der Gesundheit des Wirts zugute kommt. Mit dieser jüngsten Forschungswelle geht die Notwendigkeit einher, Protokolle für die Untersuchung von Phagen im Kontext des Darmmikrobioms zu erstellen und zu standardisieren. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung isolierter T4-Phagen und ihres bakteriellen Wirts, Escherichia coli, im Kontext des murinen Magen-Darm-Trakts. Die hier beschriebenen Methoden beschreiben, wie man von einem Phagenlysat ausgeht, es Mäusen verabreicht und die Auswirkungen auf bakterielle Wirts- und Phagenspiegel bewertet. Dieses Protokoll kann modifiziert und auf andere Phagen-Bakterien-Paare angewendet werden und bietet einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirt-Phagen-Dynamik in vivo.

Einleitung

Bakteriophagen oder Phagen sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und abtöten¹. Phagen spielen eine wichtige Rolle in komplexen Bakteriengemeinschaften wie der Darmmikrobiota, wo sie an der Regulierung der Populationsdynamik und der Förderung der bakteriellen Fitness beteiligt sind². In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung aufgrund des Aufkommens antimikrobiell resistenter Krankheitserreger³ und des Potenzials der Phagentherapie als alternative Behandlungsstrategie wieder gestiegen. In den letzten Jahren wurden lytische Phagencocktails mit....

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des UBC Animal Care Committee und den vom Biosafety Committee genehmigten Protokollen (A23-0113, B19-0038) durchgeführt. Mäuse wurden an der University of British Columbia unter pathogenfreien Bedingungen im Center for Disease Modelling untergebracht. C57BL/6-Mäuse wurden innerhalb der Anlage in einem sterilen, flexiblen Filmisolator gezüchtet, der mit steriler Mausnahrung, Wasser, Einstreu und Nistmaterial versorgt wurde. Die Mäuse wurden in einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus gehalten. Experimentelle Mäuse, sowohl männliche als auch weibliche, waren in jedem Experiment altersgleich, zwischen 6 und 12 Woc....

Diskussion

Die Untersuchung von Phagen im Mikrobiom stellt im Vergleich zu ihren bakteriellen Gegenstücken eine große Herausforderung dar. Insbesondere enthalten Phagen keinen konservierten phylogenetischen Marker, der allen Phagen gemeinsam ist, ähnlich den ribosomalen 16S- und 18S-Untereinheiten, die die Sequenzierung und Identifizierung von prokaryotischen bzw. eukaryotischen Spezies erleichtern⁴². Mit den Fortschritten bei den Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation, einschließlich der Erhö.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100