Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo

Резюме

Бактериофаги (фаги), вирусы, заражающие бактерии, являются неотъемлемым компонентом микробиома кишечника. Хотя эти симбиотические обитатели управляют бактериальной приспособленностью и динамикой популяции, мало что известно о том, как они влияют на гомеостаз кишечника и болезни. Этот протокол изучает изолированные фаги Т4 в мышиной модели, адаптируемые к другим фаго-бактериальным парам.

Аннотация

Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые инфицируют бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов и являются наиболее распространенными биологическими объектами во всех известных экосистемах. В бактериальных сообществах, таких как микробиоты кишечника, фаги участвуют в регулировании динамики популяций микробиоты и стимулируют эволюцию бактерий. В последнее десятилетие возобновился интерес к исследованиям фагов, отчасти из-за специфичной для хозяина способности литических фагов убивать, что является многообещающим инструментом для противодействия растущей угрозе устойчивых к противомикробным препаратам бактерий. Кроме того, недавние исследования, демонстрирующие, что фаги прилипают к кишечной слизи, позволяют предположить, что они могут играть защитную роль в предотвращении бактериальной инвазии в нижележащий эпителий. Важно отметить, что, как и бактериальные микробиомы, нарушенные фагеомы связаны с ухудшением исходов таких заболеваний, как воспалительные заболевания кишечника. Предыдущие исследования показали, что фаги могут модулировать микробиом животных и людей с помощью трансплантации фекальных фильтратов, принося пользу здоровью хозяина. В связи с недавней волной исследований возникла необходимость в разработке и стандартизации протоколов изучения фагов в контексте микробиома кишечника. Данный протокол предусматривает комплекс процедур для изучения изолированных фагов Т4 и их бактериального хозяина, кишечной палочки, в контексте желудочно-кишечного тракта мышей. Методы, описанные здесь, описывают, как начать с лизата фага, ввести его мышам и оценить влияние на бактериальный хозяин и уровни фагов. Этот протокол может быть модифицирован и применен к другим фаго-бактериальным парам и является отправной точкой для изучения динамики хозяин-фаг in vivo.

Введение

Бактериофаги, или фаги, — это вирусы, которые инфицируют и убивают бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов¹. Фаги играют важную роль в сложных бактериальных сообществах, таких как микробиота кишечника, где они участвуют в регулировании динамики популяций и обеспечении приспособленности бактерий². В течение последнего десятилетия возродился интерес к исследованиям фагов в связи с ростом числа устойчивых к противомикробным^{препаратам} патогенов3 и потенциалом фаговой терапии в качестве альтернативной стратегии лечения. В последние годы коктейли с литическими фагами используются внутривенн....

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями, установленными Комитетом по уходу за животными UBC и протоколами, утвержденными Комитетом по биобезопасности (A23-0113, B19-0038). Мыши были помещены в Университет Британской Колумбии в условиях, свободных от патогенов, в Центре моделирования заболеваний. Мыши C57BL/6 были выращены на объекте в стерильном изоляторе из гибкой пленки, обеспеченном стерильным мышиным кормом, водой, подстилкой и гнездовым материалом. Мышей поддерживали в 12-часовом цикле день/ночь. Экспериментальные мыши, как самцы, так и самки, были сопоставимы по возрасту в каждом эксперименте, в возрасте от 6 до 12 недель и весом 15-30 г для....

Результаты

Для изучения взаимодействий между диадой Т4-фаг/E. coli в кишечнике мышей были приготовлены, очищены и очищены Т4-фаг и транспортные лизаты (рис. 1А). Титрование лизатов фагов Т4 проводили методом бляшечного анализа и разбавляли до 2 х 10⁷ КОЕ/мл (2 х 10⁶ КОЕ/мышь) в .......

Обсуждение

Изучение фагов в микробиоме представляет собой серьезную проблему по сравнению с их бактериальными аналогами. В частности, фаги не содержат консервативного филогенетического маркера, общего для всех фагов, сходного с 16S и 18S рибосомными субъединицами, которые позволяют легко секвенир?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100