التهجين سلسلة تفاعل الحمض النووي الريبي كامل جبل مضان في الموقع تهجين الجينات الحسية الكيميائية في الزوائد الشمية البعوض

Summary

تصف المقالة الطرق والكواشف اللازمة لأداء تفاعل سلسلة التهجين RNA مضان كامل التركيب في الموقع (HCR RNA WM-FISH) للكشف عن رؤى حول الدقة المكانية والخلوية لجينات المستقبلات الحسية الكيميائية في هوائي البعوض والجس الفكي.

Abstract

البعوض هو ناقل فعال للأمراض الفتاكة ويمكنه التنقل في بيئته الكيميائية باستخدام المستقبلات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية. إن فهم كيفية تنظيم المستقبلات الحسية الكيميائية مكانيا في الزوائد الشمية الطرفية يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تشفير الرائحة في نظام حاسة الشم للبعوض وإبلاغ طرق جديدة لمكافحة انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض. يسمح ظهور الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين RNA الكامل في التهجين في التهجين الموقع (HCR RNA WM-FISH) برسم الخرائط المكانية والتنميط المتزامن للتعبير عن جينات حسية كيميائية متعددة. هنا ، نصف نهجا متدرجا لأداء HCR RNA WM-FISH على هوائي البعوض Anopheles وجس الفك العلوي. قمنا بالتحقيق في حساسية هذه التقنية من خلال فحص ملف تعريف التعبير للمستقبلات الشمية الأيونية. سألنا عما إذا كانت تقنية HCR WM-FISH الموصوفة مناسبة للدراسات المتعددة عن طريق ربط مجسات الحمض النووي الريبي بثلاثة فلوروفورات متميزة طيفيا. قدمت النتائج دليلا على أن HCR RNA WM-FISH حساس بشدة للكشف في وقت واحد عن جينات حسية كيميائية متعددة في الهوائي والزوائد الشمية الجسية الفكية. وتشهد المزيد من التحريات على ملاءمة HCR WM-FISH لتحديد سمات التعبير المشترك لأهداف الحمض النووي الريبي المزدوج والثلاثي. هذه التقنية ، عند تطبيقها مع التعديلات ، يمكن أن تكون قابلة للتكيف لتوطين الجينات ذات الأهمية في الأنسجة الشمية لأنواع الحشرات الأخرى أو في الزوائد الأخرى.

Introduction

تعتمد ناقلات البعوض مثل Anopheles gambiae على ذخيرة غنية من الجينات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية المحيطية لتزدهر في عالم كيميائي معقد وتحديد الروائح ذات الصلة سلوكيا المنبعثة من المضيفين البشريين ، واكتشاف مصادر الرحيق ، وتحديد مواقع وضع البيض¹. يتم إثراء هوائي البعوض وجس الفك العلوي بالجينات الحسية الكيميائية التي تدفع اكتشاف الرائحة في هذه الزوائد الشمية. ثلاث فئات رئيسية من القنوات الأيونية ذات البوابات تدفع الكشف عن الرائحة في الزوائد الشمية للبعوض: مستقبلات الرائحة (ORs) ، التي تعمل مع مستقبلات مستقبلات مشتعلة ملزمة للرائحة (Orco) ؛ المستقبلات الأيونية (IRs) ، التي تتفاعل مع واحد أو أكثر من مستقبلات الأشعة تحت ا....

Protocol

1. الاعتبارات وإعداد المواد

1. قرر ما إذا كان التركيب الكامل أو المقطع المبرد من الأنسجة سيكون مناسبا. تم تحسين هذا البروتوكول للتصوير الكامل في الموقع للحمض النووي الريبي في هوائي البعوض Anopheles وجس الفك العلوي دون المقطع بالتبريد. إذا كانت العينات أكثر سمكا من 5 مم ، يوصى بالتقطيع بالتبريد لتمكين اختراق المسبار.
2. تحديد الجينات ذات الأهمية ونسخ التسلسلات بما في ذلك الإنترونات والإكسونات من قاعدة بيانات مناسبة. نسخ تتابع الجينات إلى الحمض النووي الريبوزي (RNA) للتخليق.
3. حدد ما إذا كان سيتم شراء مجسات من البائعين التجاريين أو ما إذا كان سيتم تصنيع المجسات في المختبر.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تم شراء المجسا....

النتائج

الكشف القوي عن الجينات الحسية الكيميائية في هوائي الأنوفيليس
قمنا بالتحقيق في حساسية طريقة HCR FISH (الشكل 1) للكشف عن تعبير المستقبلات الحسية الكيميائية في الأنسجة الشمية للبعوض. مسترشدين ببيانات نسخة الحمض النووي الريبي التي تم الإبلاغ عنها سابقا على هوائي ?.......

Discussion

يتميز الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين (HCR) بحساسيته وقوته لتصور العديد من أهداف الحمض النووي الريبي⁸. تم استخدام HCR WM-FISH بنجاح على أجنة ذبابة الفاكهة والدجاج والفئران وسمك الزرد وكذلك يرقات الديدان الخيطية وسمك الزرد^10،16،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent