Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В статье описаны методы и реагенты, необходимые для проведения гибридизации цепной реакции РНК флуоресценции in situ (HCR RNA WM-FISH) для получения информации о пространственном и клеточном разрешении генов хемосенсорных рецепторов в антенне комара и верхнечелюстных пальпах.

Аннотация

Комары являются эффективными переносчиками смертельных болезней и могут ориентироваться в химической среде с помощью хемосенсорных рецепторов, экспрессируемых в их обонятельных придатках. Понимание того, как хемосенсорные рецепторы пространственно организованы в периферических обонятельных придатках, может дать представление о том, как запах кодируется в обонятельной системе комаров, и проинформировать о новых способах борьбы с распространением заболеваний, переносимых комарами. Появление гибридизации цепной реакции РНК с флуоресценцией in situ (HCR RNA WM-FISH) позволяет осуществлять пространственное картирование и одновременное профилирование экспрессии нескольких хемосенсорных генов. В данной статье мы опишем поэтапный подход к выполнению HCR РНК WM-FISH на антенне комаров Anopheles и верхнечелюстных пальпах. Мы исследовали чувствительность этой методики, изучив профиль экспрессии ионотропных обонятельных рецепторов. Мы спросили, подходит ли описанная техника HCR WM-FISH для мультиплексных исследований путем привязки РНК-зондов к трем спектрально различным флуорофорам. Полученные результаты свидетельствуют о том, что HCR РНК WM-FISH обладает высокой чувствительностью к одновременному обнаружению нескольких хемосенсорных генов в антенне и верхнечелюстных пальпированных обонятельных придатках. Дальнейшие исследования подтверждают пригодность HCR WM-FISH для профилирования коэкспрессии мишеней с двойной и тройной РНК. Этот метод, применяемый с модификациями, может быть адаптирован для локализации интересующих генов в обонятельных тканях других видов насекомых или в других придатках.

Введение

Комары-переносчики, такие как Anopheles gambiae, полагаются на богатый репертуар хемосенсорных генов, экспрессируемых в их периферических обонятельных придатках, чтобы процветать в сложном химическом мире и идентифицировать поведенчески значимые запахи, исходящие от людей-хозяев, обнаруживать источники нектара и находитьместа яйцекладки. Антенна комара и верхнечелюстные щупики обогащены хемосенсорными генами, которые управляют обнаружением запаха в этих обонятельных придатках. Три основных класса лиганд-зависимых ионных каналов управляют обнаружением запаха в обонятельных придатках комаров: рецепторы одоранта (OR), которые функционирую....

протокол

1. Рассмотрение и подготовка материалов

  1. Решите, будет ли уместна целая монтировка или криосрез ткани. Этот протокол оптимизирован для визуализации РНК in situ в антенне комаров Anopheles и верхнечелюстных пальпах без криосекции. Если толщина образцов превышает 5 мм, рекомендуется криосекционирование для проникновения зонда.
  2. Определите интересующие гены и скопируйте последовательности, включая интроны и экзоны, из подходящей базы данных. Транскрибируйте последовательность гена в РНК для синтеза.
  3. Определите, следует ли приобретать зонды у коммерческих поставщиков или зонды будут синтезироваться в лаборатор....

Результаты

Надежное обнаружение хемосенсорных генов в антенне Anopheles
Исследована чувствительность метода HCR FISH (рис. 1) для выявления экспрессии хемосенсорных рецепторов в обонятельных тканях комаров. Руководствуясь данными транскрипции РНК, о которых сообщалось р?.......

Обсуждение

Третье поколение гибридизационной цепной реакции (ГЦР) отличается чувствительностью и надежностью для визуализации нескольких мишеней РНК8. HCR WM-FISH был успешно применен на эмбрионах дрозофилы, курицы, мыши и рыбки данио, а также на личинках нематод и рыбок данио-рерио

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Марго Херре (Margo Herre) и лабораторию Лесли Восшалла (Leslie Voshall) за то, что они поделились своим протоколом гибридизации in situ для обонятельных придатков Aedes aegypti . Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения для C.J.P. (NIAID R01Al137078), стипендией HHMI Ханны Грей для J.I.R., премией Джонса Хопкинса для постдокторантуры J.I.R. и постдокторской стипендией Института исследования малярии Джонса Хопкинса для J.I.R. Мы благодарим Научно-исследовательский институт малярии Университета Джонса Хопкинса и Благотворительный фонд Блумберга за поддержку.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplification bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitinaseSigma-AldrichC6137-50UN
ChymotrypsinSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf tubeVWR20901-5511.5 mL
ForcepsDumont11251Number 5
Gel loading tipCostar48531-200 µL tip
Hairpins Molecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescenceh1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)Sigma-AldrichH0887
IR25a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK149 AGAP010272
IR41t.1 probeMolecular Instruments Probe Set ID: PRK978AGAP004432
IR64a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK700 AGAP004923
IR75d probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK976AGAP004969
IR76b probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRI998AGAP011968
IR7t probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRL355AGAP002763
IR8a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK150AGAP010411
LoBind TubesVWR80077-2360.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MethanolFisher A412-500
Nuclease-free waterThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModel 1353-D Mini rocker
Orco probeMolecular InstrumentsProbe set ID PRD954AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )Electron Microscopy Services 15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Probe hybridization bufferMolecular Instrumentshttps://www.molecularinstruments.com/50 mL
Probe wash bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence100 mL
Proteinase-KThermo FisherAM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
SlowFade DiamondThermo Fisher S36972mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10%)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10% )TeknovaT0027
Watch glassCarolina742300 1 5/8" square; transparent

Ссылки

  1. Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
  2. Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 1....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены