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要約

本稿では、ハイブリダイゼーション、連鎖反応、RNA、ホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)を行い、蚊の触角と上顎触覚における化学感覚受容体遺伝子の空間的および細胞的分解能に関する洞察を明らかにするために必要な方法と試薬について説明します。

要約

蚊は致命的な病気の効果的な媒介者であり、嗅覚付属器に発現する化学感覚受容体を使用して化学的環境をナビゲートできます。化学感覚受容体が末梢嗅覚付属器官で空間的にどのように組織化されているかを理解することは、蚊の嗅覚系で匂いがどのようにコード化されているかについての洞察を提供し、蚊が媒介する病気の蔓延に対抗する新しい方法を知らせることができます。第3世代ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)の出現により、複数の化学感覚遺伝子の空間マッピングと同時発現プロファイリングが可能になります。ここでは、 ハマダラカ の蚊の触角と上顎触覚でHCR RNA WM-FISHを実行するための段階的なアプローチについて説明します。我々は、イオン性嗅覚受容体の発現プロファイルを調べることにより、この手法の感度を調べました。記載されたHCR WM-FISH法が、スペクトル的に異なる3つの蛍光色素にRNAプローブをつなぎ合わせたマルチプレックス研究に適しているかどうかを尋ねました。その結果、HCR RNA WM-FISHは、触角と上顎触覚嗅覚付属器の複数の化学感覚遺伝子を同時に検出する堅牢性を示す証拠が得られました。さらなる調査により、HCR WM-FISHが二重および三重RNAターゲットの共発現プロファイリングに適していることが証明されています。この手法を改変して適用すると、他の昆虫種の嗅覚組織や他の付属肢の目的の遺伝子を局在化するために適応できる可能性があります。

概要

ガンビエハマダラカなどの媒介蚊は、末梢の嗅覚付属器官に発現する化学感覚遺伝子の豊富なレパートリーに依存して、複雑な化学的世界で繁栄し、ヒトの宿主から発せられる行動に関連する匂いを識別し、蜜源を検出し、産卵部位を特定します1。蚊の触角と上顎触覚には、これらの嗅覚付属器の匂い検出を駆動する化学感覚遺伝子が豊富に含まれています。蚊の嗅覚付属器の匂い検出を駆動するリガンド依存性イオンチャネルの3つの主要なクラス:必須の匂い受容体共受容体(ORCO)で機能する匂い受容体(OR)。1つ以上のIRコレセプター(IR8a、IR25a、およびIR76b)と相互作用するイオノトロピック受容体(IR)。化学感覚味覚受容体(GR)は、二酸化炭素(CO2)を検出するための3つのタンパク質の複合体として機能します1,2。

RNA蛍光in situハイブリダイゼーションは、内因性mRNAの発現を検出するための強力なツールです3。一般に、この方法は、標的mRNAと相補的な配列を持つ蛍光色素タグ付き一本鎖核酸プローブを利用します。蛍光RNAプローブを標的RNAに結合させることで、目的の転写産物を発現する細胞を同定することができます。最近の進歩により、蚊の組織全体から転写産物を検出できるようになりました4,5。第1世代のハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)技術では、RNAベースのHCR増幅器が使用されました。これは、HCR増幅器6,7に人工DNAを使用する第2世代の方法で改良されました。このアップグレードにより、シグナルが10倍に増加し、製造コストが劇的に低下し、試薬の耐久性が大幅に向上しました6,7。

プロトコルでは、私達はあらゆる遺伝子8,9の空間的な局在そして表現を検出するために設計されている第3世代HCRのホールマウントRNAの蛍光性その場の交配(HCR RNA WM-FISH)方法の利用を記述する。この2段階の方法は、まず、目的のmRNAに特異的であるが、イニシエーター認識配列も含む核酸プローブを利用します。第2ステップでは、イニシエーター配列に結合する蛍光色素タグ付きヘアピンを利用して蛍光シグナルを増幅します(図1)。また、この方法では、2つ以上のRNAプローブの多重化およびプローブシグナルの増幅が可能になり、RNAの検出および定量が容易になる8。嗅覚付属器に発現する化学感覚遺伝子の転写産物量とRNA局在パターンを可視化することで、化学感覚遺伝子の機能と匂いのコーディングに関する最初の洞察が得られます。

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プロトコル

1. 資料の検討と準備

  1. 組織のホールマウントまたはクライオセクションのどちらが適切かを判断します。このプロトコルは、ハマダラカのアンテナと上顎触覚のRNAを凍結切断せずに、その場でイメージングするために最適化されています。サンプルの厚さが5mmを超える場合は、プローブの浸透を可能にするためにクライオセクショニングが推奨されます。
  2. 目的の遺伝子を同定し、イントロンやエクソンなどの配列を適切なデータベースからコピーします。遺伝子配列をRNAに転写して合成します。
  3. プローブを商用ベンダーから購入するか、プローブをラボで合成するかを決定します。
    注:この研究では、 in situ プローブは市販業者から購入しました( 材料表を参照)。或いは、先に報告された10のように合成することもできる。本研究で使用した試薬を 表1に記載します。試薬の調製に必要な材料は、 材料表に記載されています。

2.組織の固定前

  1. 羽化後5〜10日経過した10〜15匹の成虫の雌または雄の ハマダラカ (N'Gousso株)を、口吸引器で紙コップまたはプラスチックチューブに集め、氷の入ったバケツに入れて麻酔をかけます。風邪による麻酔が成功するかどうかは、蚊が動かないときに確認することができます。
  2. 一対の鉗子で首の領域から頭を取り除き、それらを斬首します。利き手ではない方の手で鉗子で胸郭をつかみ、利き手で持った鉗子で首を体から離します。500 μL のキチナーゼ-キモトリプシンジメチルスルホキシドバッファー(CCD バッファー)を含む 1.5 mL チューブにヘッドを氷上に置いてください。
    注意: 動物を凍らせると、触角が変形する可能性があります。氷上でのクイックノックダウンをお勧めします。テスト中の蚊の年齢は、プロジェクトによって異なる場合があります。血を飲ませているのか、飢餓状態なのか、交尾しているのかなど、生理学的状態を確認し、調整することが重要です。この研究では、吸血と交尾を行った蚊から嗅覚付属肢をサンプリングしました。
  3. カの頭をCCD緩衝液中の37°Cでヒートブロック上で5分間予熱し、次いで、蚊頭を含むチューブをハイブリダイゼーションオーブンに移し、37°Cで回転させる。ハ マダラカ の雌の触角には20分、雄の触角には15分、上顎触角にはより長い潜伏時間(1時間)が必要です。
  4. チューブの内容物全体を解剖時計グラスに移します。時計(解剖)ガラスのくぼみにサンプルをそっと注ぎます。蚊の頭がチューブ内に詰まっている場合は、ピペットを使用してCCDバッファーをチューブに追加し、頭を洗い流します。
  5. 鉗子を使用して、インキュベーション中に取り外した頭部または触角/触覚を慎重に移し、1 mLの予備固定剤に固定します。
    注:残ったCCDバッファーは-20°Cで保存でき、バッファーは最大3倍まで再利用できます。組織によるCCDバッファーのキャリーオーバーにより、予備固定剤がわずかに茶色がかった色に変わる場合は、別の1 mLの固定液と交換してください。
  6. 分厚いものを使用して、4°Cで24時間ヘッドを予備固定液で回転させます。
    注:この研究で使用した分厚いネーターの揺動速度は調整できませんでした。メーカーが設定したデフォルトの速度(12rpm)を使用しました。

3.組織解剖

  1. すすぎヘッドを4回(1回の洗浄で5分)に1 mLの0.1% PBS-Tweenで氷上で行います。サンプルの損失を防ぐため、ゲルローディングチップに取り付けられたピペットを使用して液体を除去します。
    注意: 2回のクイックウォッシュの後に10分間の洗浄を行い、ステップ3.1の代わりに最後のクイックウォッシュを実行できます。
  2. チューブ内のヘッドを解剖時計ガラスに移します。時計のガラスのくぼみにサンプルをそっと注ぎます。チューブ内に詰まっている蚊の頭を0.1%PBS-Tweenで洗い流します。
  3. 解剖顕微鏡下で、鋭利な鉗子で目的の組織(触角/触覚)を頭から取り除きます。頭の後部を鉗子で持ち、基部から別の鉗子でアンテナをつかみます。RNAseフリー溶媒で湿らせた紙で鉗子を洗浄します。同じプロセスを使用して触覚を取り除きます。
  4. 鉗子で触角と触覚を、氷上に置かれた空のDNA/RNaseフリーチューブに移します。異なる組織部分を、事前にラベル付けされた異なるチューブに分離します。
  5. メタノール(MeOH 80%)とジメチルスルホキシド(DMSO 20%)の混合物を含む400 μLの溶媒で、室温で1時間、組織を脱水します。
    注:乳母にティッシュを置く必要はありません。ラボベンチの室温でチューブラックに置きます。新鮮な溶媒混合物を使用することをお勧めします。500 μLのストック溶液の場合、400 μLのMeOHと100 μLのDMSOを混合します。
  6. 脱水試薬を400 μLの無水(100%)メタノールと交換し、-20°Cで一晩組織を脱水します。組織を重力で沈降させ、ピペットを使用して液体を取り除きます。
    注:サンプルは長期間の脱水に耐えられ、最大4泊まで信号を失うことなくテストされています。

4. 組織固定後

  1. 段階付けした400 μLのMeOH/PBS-Tweenを氷上で10分間、4段階に分けて組織を再水和します。75%MeOH/25%PBSトゥイーン、50%MeOH/50%PBS-トゥイーン、25%MeOH/75%PBS-トゥイーン、最後に100%PBS-トゥイーンと続きます。
    注:小さな開口部を持つゲルローディングチップを使用して、組織の損失を防ぐためにチューブからバッファーを除去できます。緩衝液の除去は、解剖顕微鏡下で行うことができます。
  2. 0.1% Tween-20(PBS-T)を含むリン酸緩衝生理食塩水400 μLで室温で10分間洗浄します。サンプルを乳化剤に置いて洗浄します。
  3. 20 μg/mL のプロテイナーゼ-K 溶液を調製し、400 μL のプロテイナーゼ-K 溶液中で室温で 30 分間インキュベートします。
    注:20 mg/mL のプロテイナーゼ-K ストック(1000 倍ストック溶液)を希釈し、2 μL を 0.1% PBS-Tween 2 mL で希釈します。残り物は-20°Cの冷凍庫で保存できます。
  4. 400 μLの0.1% PBS-tweenで2回10分間洗浄することにより、組織の酵素消化を停止します。
  5. 400 μLの後固定液を加え、室温で20分間インキュベートします。400 μL の 0.1% PBS-Tween で 3 回、1 回の洗浄にあたり 15 分間洗浄します。

5. プローブハイブリダイゼーション

  1. 400μLのプローブハイブリダイゼーションバッファー中で組織を5分間インキュベートします。静かにピペッティングして、組織がバッファーに完全に沈んでいることを確認します。
  2. プローブハイブリダイゼーションバッファーのアリコートを37°Cで30分間加熱することにより、次のステップの準備をします。
  3. 緩衝液を除去し、400μLの予熱したプローブハイブリダイゼーション緩衝液で37°Cで30分間プレハイブリダイズする。
  4. 8 pMのプローブを添加して、標的化学感覚受容体(IR8a、IR76b、IR25a、IR41t.1、IR75d、IR7t、IR64a、またはOrco)のプローブ溶液を作成します。8 μLの1 μMプローブストックを500 μLの予熱プローブハイブリダイゼーションバッファーに加えます。
  5. 予熱したプローブハイブリダイゼーションバッファーを除去し、400μLの加熱プローブ溶液と交換します。
  6. インキュベーター内に置き、箱の下に覆ったニューテーターの上で37°Cで2晩組織をインキュベートします。

6. プローブ増幅

  1. プローブ洗浄バッファーを37°Cに加熱し、組織を5回、1回の洗浄あたり10分間、400μLのプローブ洗浄バッファーで37°Cで洗浄し、インキュベーターでヌーティングすることにより、余分なプローブ溶液を除去します。
    メモ: 手順 6.4 の準備が始まる場合があります。手順 6.4 の注を参照してください。
  2. 10% Tween-20(SSCT)を含む5x生理食塩水-クエン酸ナトリウム400 μLで、サンプルを2回、5分間室温で洗浄します。増幅バッファーをベンチトップで室温まで解凍します。
  3. 400 μLの増幅バッファーと室温で10分間インキュベートすることにより、増幅用の組織を調製します。増幅バッファーの粘度により、組織が完全に浸漬しない場合があります。増幅バッファーを組織の下に静かにピペッティングし、バッファーを組織上部に沈むまで排出して混合します。
  4. 6 μL の 3 μM ストックを 95 °C で 90 秒間加熱し、暗所の引き出しで室温まで 30 分間冷却することにより、ヘアピン h1 1 の 18 pM とヘアピン h2 の 18 pM を別々に調製します。サーマルサイクラーで加熱している間にヘアピンが蒸発しないように、PCRチューブがしっかりとキャップされていることを確認してください。
    注意: 時間を節約するために、ステップ6.4の4番目の 洗浄ステップでステップ6.1を開始できます。ヘアピンは、交差反応を防ぐために個別に加熱する必要があります。このステップでは、ヘアピンをバッファーで希釈しないでください。ヘアピンは、プローブと一緒にプローブメーカーから購入できます。
  5. ステップ6.3で添加した増幅バッファーを、加熱したヘアピン(ステップ6.4)と100 μLの増幅バッファーを含む混合物と交換します。典型的な反応液には、6 μLのh1、6 μLのh2、および100 μLの増幅バッファーが含まれます。
    注:ヘアピン h1 と h2 は、室温まで冷却した後、100 μL の増幅バッファーに添加して組み合わせることができます。組織試料を1本のチューブから別のチューブに移すことを避けるために、ステップ6.3の増幅バッファーを除去し、増幅バッファーで希釈したヘアピン混合物で置き換えることができる。
  6. 組織を一晩インキュベートし、消毛器のデフォルト速度を使用して室温で暗所でヌーテーします。

7. 組織サンプルの取り付け

  1. インキュベートした組織内の増幅バッファーを300 μLの5x SSCT(Tween-20で希釈した塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウム)で希釈します。
    注:希釈は粘度を下げるのに役立ち、組織から増幅バッファーを除去しやすくします。前固定剤にはTriton-X 100を、固定後工程にはTween-20を使用しましたが、これは細胞膜透過剤としての作用が異なるためです。
  2. 400 μL の 5x SSCT で組織を室温で 5 回洗浄します。
    注:必要に応じて、取り付けの準備が整うまで、ティッシュを4°Cで一時的に保管してください。撮影まで2日を超えていません。
  3. スライドガラス上に封入液を5滴作ります。200 μLのピペットチップの先端を切断して幅を広げ、組織を新しいスライドガラスに移します。
  4. 鉗子で組織サンプルのベースをつかみ、一連の封入液滴に静かに浸してすすぎます。このステップでは、組織を壊さないように注意してください。
  5. 取り付け液で取り付け、カバーガラスを配置し、マニキュアで密封します。共焦点顕微鏡を用いた in situ 組織サンプルのイメージング。

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結果

ハマダラカアンテナにおける化学感覚遺伝子の頑健な検出
HCR FISH法(図1)の感度を調べ、蚊の嗅覚組織における化学感覚受容体の発現を検出しました。ハマダラカの雌の触角で以前に報告されたRNA転写データに導かれて、さまざまなIRを標的とするプローブを生成しました。4つの独立した触角トランスクリプトーム研究の平均転写値から、Ir41t...

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ディスカッション

第3世代のハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)は、いくつかのRNA標的を可視化する感度と頑健性で注目に値します8。HCR WM-FISHは、ショウジョウバエ、ニワトリ、マウス、ゼブラフィッシュの胚、線虫やゼブラフィッシュの幼虫に使用されています10,16,17。蚊の触角と上顎触角は、通常、自家蛍光が?...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

ネ ッタイシマカ の嗅覚付属器のin-situハイブリダイゼーションプロトコルを共有してくれたMargo Herre氏とLeslie Voshall研究室に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIAID R01Al137078)からC.J.P.への助成金、J.I.R.へのHHMIハンナ・グレイ・フェローシップ、J.I.R.へのジョンズ・ホプキンス博士研究員アクセラレーター賞、J.I.R.へのジョンズ・ホプキンス・マラリア研究所ポスドク・フェローシップによって支援されました。ジョンズ・ホプキンス大学マラリア研究所とブルームバーグ・フィランソロピーズのご支援に感謝いたします。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplification bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitinaseSigma-AldrichC6137-50UN
ChymotrypsinSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf tubeVWR20901-5511.5 mL
ForcepsDumont11251Number 5
Gel loading tipCostar48531-200 µL tip
Hairpins Molecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescenceh1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)Sigma-AldrichH0887
IR25a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK149 AGAP010272
IR41t.1 probeMolecular Instruments Probe Set ID: PRK978AGAP004432
IR64a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK700 AGAP004923
IR75d probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK976AGAP004969
IR76b probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRI998AGAP011968
IR7t probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRL355AGAP002763
IR8a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK150AGAP010411
LoBind TubesVWR80077-2360.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MethanolFisher A412-500
Nuclease-free waterThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModel 1353-D Mini rocker
Orco probeMolecular InstrumentsProbe set ID PRD954AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )Electron Microscopy Services 15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Probe hybridization bufferMolecular Instrumentshttps://www.molecularinstruments.com/50 mL
Probe wash bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence100 mL
Proteinase-KThermo FisherAM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
SlowFade DiamondThermo Fisher S36972mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10%)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10% )TeknovaT0027
Watch glassCarolina742300 1 5/8" square; transparent

参考文献

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