ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 蚊の嗅覚付属器における化学感覚遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション

要約

本稿では、ハイブリダイゼーション、連鎖反応、RNA、ホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)を行い、蚊の触角と上顎触覚における化学感覚受容体遺伝子の空間的および細胞的分解能に関する洞察を明らかにするために必要な方法と試薬について説明します。

要約

蚊は致命的な病気の効果的な媒介者であり、嗅覚付属器に発現する化学感覚受容体を使用して化学的環境をナビゲートできます。化学感覚受容体が末梢嗅覚付属器官で空間的にどのように組織化されているかを理解することは、蚊の嗅覚系で匂いがどのようにコード化されているかについての洞察を提供し、蚊が媒介する病気の蔓延に対抗する新しい方法を知らせることができます。第3世代ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)の出現により、複数の化学感覚遺伝子の空間マッピングと同時発現プロファイリングが可能になります。ここでは、 ハマダラカ の蚊の触角と上顎触覚でHCR RNA WM-FISHを実行するための段階的なアプローチについて説明します。我々は、イオン性嗅覚受容体の発現プロファイルを調べることにより、この手法の感度を調べました。記載されたHCR WM-FISH法が、スペクトル的に異なる3つの蛍光色素にRNAプローブをつなぎ合わせたマルチプレックス研究に適しているかどうかを尋ねました。その結果、HCR RNA WM-FISHは、触角と上顎触覚嗅覚付属器の複数の化学感覚遺伝子を同時に検出する堅牢性を示す証拠が得られました。さらなる調査により、HCR WM-FISHが二重および三重RNAターゲットの共発現プロファイリングに適していることが証明されています。この手法を改変して適用すると、他の昆虫種の嗅覚組織や他の付属肢の目的の遺伝子を局在化するために適応できる可能性があります。

概要

ガンビエハマダラカなどの媒介蚊は、末梢の嗅覚付属器官に発現する化学感覚遺伝子の豊富なレパートリーに依存して、複雑な化学的世界で繁栄し、ヒトの宿主から発せられる行動に関連する匂いを識別し、蜜源を検出し、産^卵部位を特定します1。蚊の触角と上顎触覚には、これらの嗅覚付属器の匂い検出を駆動する化学感覚遺伝子が豊富に含まれています。蚊の嗅覚付属器の匂い検出を駆動するリガンド依存性イオンチャネルの3つの主要なクラス:必須の匂い受容体共受容体(ORCO)で機能する匂い受容体(OR)。1つ以上のIRコレセプター(IR8a、IR25a、およびIR76b)と相互作用するイオノトロピック受容体(IR)。化学感覚味覚受容体(GR)は、二酸化炭素(CO₂)^{を検出する}ための3つのタンパク質の複合体として機能します^1,2。

RNA蛍光in situハイブリダイゼーションは、内因性mRNAの発現を検出するための強力なツール^です3。一般に、この方法は、標的mRNAと相補的な配列を持つ蛍光色素タグ付き一本鎖核酸プローブを利用します。蛍光RNAプローブを標的RNAに結合させることで、目的の転写産物を発現する細胞を....

プロトコル

1. 資料の検討と準備

1. 組織のホールマウントまたはクライオセクションのどちらが適切かを判断します。このプロトコルは、ハマダラカのアンテナと上顎触覚のRNAを凍結切断せずに、その場でイメージングするために最適化されています。サンプルの厚さが5mmを超える場合は、プローブの浸透を可能にするためにクライオセクショニングが推奨されます。
2. 目的の遺伝子を同定し、イントロンやエクソンなどの配列を適切なデータベースからコピーします。遺伝子配列をRNAに転写して合成します。
3. プローブを商用ベンダーから購入するか、プローブをラボで合成するかを決定します。
   注:この研究では、 in situ プローブは市販業者から購入しました( 材料表を参照)。或いは、先に報告された¹⁰のように合成することもできる。本研究で使用した試薬を 表1に記載します。試薬の調製に必要な材料は、 材料表に記載されています。

2.組織の固定前

1. 羽化後5〜10日経過した10〜15匹の成虫の雌または雄の ハマダラカ (N'Gousso株)を、口吸引....

ディスカッション

第3世代のハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)は、いくつかのRNA標的を可視化する感度と頑健性で注目に値します⁸。HCR WM-FISHは、ショウジョウバエ、ニワトリ、マウス、ゼブラフィッシュの胚、線虫やゼブラフィッシュの幼虫に使用されています10,16,17。蚊の触角と上顎触角は、通常、自家蛍光が?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent