杂交链式反应 RNA全山荧光 蚊子嗅附物化学感觉基因 的原位 杂交

摘要

本文介绍了进行杂交链式反应 RNA 全座荧光 原位 杂交 （HCR RNA WM-FISH） 所需的方法和试剂，以揭示对蚊子触角和上颌触诊中化学感觉受体基因的空间和细胞分辨率的见解。

摘要

蚊子是致命疾病的有效载体，可以使用在其嗅觉附属物中表达的化学感觉受体在其化学环境中导航。了解化学感觉受体在外周嗅觉附属物中的空间组织方式，可以深入了解气味如何在蚊子嗅觉系统中编码，并为对抗蚊媒疾病的传播提供新方法。第三代杂交链式反应RNA全座荧光 原位 杂交（HCR RNA WM-FISH）的出现允许多个化学感觉基因的空间定位和同时表达谱。在这里，我们描述了在 按蚊 天线和上颌触诊上执行 HCR RNA WM-FISH 的逐步方法。我们通过检查离子型嗅觉受体的表达谱来研究该技术的敏感性。我们询问所描述的HCR WM-FISH技术是否适用于通过将RNA探针拴在三个光谱不同的荧光团上的多重研究。结果表明，HCR RNA WM-FISH对同时检测触角和上颌触诊嗅觉附肢中的多个化学感觉基因具有很强的敏感性。进一步的研究证明了HCR WM-FISH适用于双RNA和三RNA靶标的共表达谱。当应用修改时，这种技术可以适应于定位其他昆虫物种的嗅觉组织或其他附属物中感兴趣的基因。

引言

冈比亚按蚊等蚊媒依靠在其外周嗅觉附属物中表达的丰富的化学感觉基因库，在复杂的化学世界中茁壮成长，并识别来自人类宿主的行为相关气味，检测花蜜来源，并定位产卵部位¹。蚊子触角和上颌触诊富含化学感觉基因，这些基因驱动这些嗅觉附属物的气味检测。三大类配体门控离子通道驱动蚊子嗅觉附属物的气味检测：气味受体 （OR），它与专性气味受体共受体 （Orco） 一起发挥作用;离子型受体 （IR），与一个或多个 IR 辅助受体（IR8a、IR25a 和 IR76b）相互作用;化学感觉味觉受体 （GR），它作为三种蛋白质的复合物来检测二氧化碳 （CO₂）^1,2。

RNA荧光原位杂交是检测内源性mRNA³表达的有力工具。通常，该方法使用荧光团标记的单链核酸探针，其序列与靶 mRNA 互补。荧光RNA探针与靶RNA的结合可以鉴定表达目标转录本的细胞。最近的进展现在能够检测整个蚊子组织中的转录本 ^4,5。第一代杂交链式反应（HCR）技术使用基于RNA的HCR扩增器;这在第二代方法中得到了改进，该方法将工程DNA用于HCR扩增^6,7。这一升级使信号增加了 10 倍，生产成本大幅降低，并显著提高了试剂的耐久性 ^6,7。

在方案中，我们描述了第三代HCR全座RNA荧光原位杂交（HCR RNA WM-FISH）方法的利用，该方法旨在检测任何基因的空间定位和表达^8,9。这种两步法首先利用对目标 mRNA 具有特异性的核酸探针，但其中也包含启动子识别序列;第二步利用荧光团标记的发夹，该发夹与引发剂序列结合以放大荧光信号（图1）。该方法还允许两个或多个 RNA 探针的多重检测和扩增探针信号，以促进 RNA 检测和定量⁸。可视化嗅觉附属物中表达的化学感觉基因的转录本丰度和 RNA 定位模式，为了解化学感觉基因功能和气味编码提供了第一线。

研究方案

1. 材料的考虑和准备

1. 确定组织全贴片或冷冻切片是否合适。该协议针对按蚊天线和上颌触诊中RNA的全位原位成像进行了优化，无需冷冻切片。如果样品厚度大于 5 mm，建议进行冷冻切片以使探针穿透。
2. 鉴定感兴趣的基因，并从合适的数据库中复制序列，包括内含子和外显子。将基因序列转录成RNA进行合成。
3. 确定是否从商业供应商处购买探针，或者是否在实验室中合成探针。
   注：在这项研究中， 原位 探针是从商业供应商处购买的（见 材料表）。或者，它可以像先前报道^的10一样合成。表 1描述了研究中使用的试剂。制备试剂所需的材料列在 材料表中。

2.组织预固定

1. 麻醉 10-15 只成年雌性或雄性 Coluzzii 按蚊 （菌株 N'Gousso），在出现后 5-10 天，用口吸器将它们收集到纸杯或塑料管中，并将它们放入装有冰块的桶中。当蚊子不动时，可以确认成功的冷诱导麻醉。
2. 用一把镊子从颈部区域取下头部，将它们斩首。用非惯用手抓住胸部，用惯用手握住的镊子将颈部与身体分开。将头部放入含有 500 μL 几丁质酶-胰凝蛋白酶二甲基亚砜缓冲液（CCD 缓冲液）的 1.5 mL 管中。
   注意：冷冻动物会使触角变形;建议在冰上快速击倒。测试期间蚊子的年龄可能因项目而异。确认和协调它们的生理状态很重要，例如它们是以血为食、饥饿还是交配。在这项研究中，嗅觉附属物是从经过血液喂养和交配的蚊子身上取样的。
3. 在37°C的CCD缓冲液中将蚊子头在加热块上预热5分钟，然后将含有蚊子头的管转移到杂交炉中并在37°C下旋转。对于雌性 按蚊 触角，使用20分钟，雄性触角需要15分钟，而上颌触须需要更长的孵育时间（1小时）。
4. 将试管的全部内容物转移到解剖手表玻璃中。轻轻地将样品倒入手表（解剖）玻璃的凹陷处。如果蚊子头卡在试管内，请使用移液管将CCD缓冲液添加到试管中并冲洗掉蚊头。
5. 使用镊子小心地转移在孵育过程中分离的头部或任何触角/触须，并固定在 1 mL 的预固定剂中。
   注意：剩余的CCD缓冲液可以在-20°C下保存，缓冲液可以重复使用3倍。如果预固定剂由于组织携带的 CCD 缓冲液而略呈褐色，请用另外 1 mL 固定剂代替。
6. 使用螺母器在4°C下将头旋转24小时。
   注意：本研究中使用的悸动器的摇摆速度不可调;使用制造商设置的默认速度 （12 rpm）。

3.组织解剖

1. 用 1 mL 0.1% PBS-吐温在冰上冲洗头 4 次（每次洗涤 5 分钟）。为避免样品损失，请使用连接到凝胶上样吸头的移液管除去液体。
   注意：两次快速洗涤，然后进行 10 分钟的长时间洗涤，最后可以执行快速洗涤，而不是步骤 3.1。
2. 将管中的头部转移到解剖手表玻璃中。轻轻将样品倒入手表玻璃的凹陷处。用 0.1% PBS-Tween 冲洗卡在管内的蚊子头。
3. 在解剖显微镜下，用锋利的镊子从头部取出感兴趣的组织（触角/触诊）。用镊子握住头部的后部，然后用另一根镊子从底部抓住一根天线。用不含RNAse的溶剂润湿的纸清洁镊子。使用相同的过程取下触诊。
4. 用镊子将触角和触诊转移到放置在冰上的无DNA/RNase空管中。将不同的组织部分分成预先标记的不同试管。
5. 在室温下，在含有甲醇（MeOH 80%）和二甲基亚砜（DMSO 20%）混合物的400μL溶剂中脱水组织1小时。
   注意： 无需将纸巾放在 nutator 上;让它在室温下放在实验室工作台上的试管架上。建议使用新鲜的溶剂混合物。对于 500 μL 储备溶液，将 400 μL MeOH 与 100 μL DMSO 混合。
6. 用400μL无水（100%）甲醇代替脱水试剂，并在-20°C下使组织脱水过夜。让组织在重力作用下沉降，然后用移液管除去液体。
   注意：样品可长时间脱水，最多 4 晚已测试过，没有信号丢失。

4. 组织固定后

1. 在冰上用分级的400μL MeOH / PBS-Tween的四步系列组织再水化10分钟。从 75% MeOH/25% PBS-吐温开始，然后是 50% MeOH/50% PBS-吐温，然后是 25% MeOH/75% PBS-吐温，最后是 100% PBS-吐温。
   注意：可以使用带有微小开口的凝胶加载尖端从试管中取出缓冲液，以避免丢失组织。缓冲液去除可以在解剖显微镜下完成。
2. 在室温下用含有 0.1% 吐温-20 （PBS-T） 的 400 μL 磷酸盐缓冲盐水洗涤 10 分钟。将样品放在导向器上清洗。
3. 制备 20 μg/mL 蛋白酶-K 溶液，并在室温下在 400 μL 蛋白酶-K 溶液中孵育 30 分钟。
   注：稀释 20 mg/mL 蛋白酶-K 储备液（1000x 储备溶液），即 2 μL 在 2 mL 0.1% PBS-吐温中。剩下的可以储存在-20°C冰箱中。
4. 用 400 μL 0.1% PBS-吐温洗涤 2 次 10 分钟，停止组织的酶消化。
5. 加入 400 μL 后固定剂，并在室温下孵育 20 分钟。用 400 μL 0.1% PBS-吐温洗涤 3 次，每次洗涤 15 分钟。

5. 探针杂交

1. 将组织在 400 μL 探针杂交缓冲液中孵育 5 分钟。通过轻轻移液确保组织完全浸没在缓冲液中。
2. 通过将探针杂交缓冲液的等分试样加热至37°C30分钟来准备下一步。
3. 除去缓冲液，用400μL预热的探针杂交缓冲液在37°C下预杂交30分钟。
4. 通过添加 8 pM 探针，为目标化学感觉受体（IR8a、IR76b、IR25a、IR41t.1、IR75d、IR7t、IR64a 或 Orco）制备探针溶液。将 8 μL 1 μM 探针原液加入 500 μL 预热探针杂交缓冲液中。
5. 取出预热的探针杂交缓冲液，并用 400 μL 加热的探针溶液代替。
6. 将组织在37°C下孵育两晚，放置在培养箱内并盖在盒子下的导向器上。

6. 探针放大

1. 将探针洗涤缓冲液加热至37°C，通过冲洗组织5次，每次洗涤10分钟，在37°C下用400μL探针洗涤缓冲液，在培养箱中交动，除去多余的探针溶液。
   注意：步骤 6.4 的准备工作可能会开始。请参阅步骤 6.4 中的注释。
2. 在室温下用含有 10% 吐温-20 （SSCT） 的 400 μL 5x 盐水柠檬酸钠洗涤样品 2 次，每次洗涤 5 分钟。在工作台上将扩增缓冲液解冻至室温。
3. 通过在室温下与 400 μL 扩增缓冲液孵育 10 分钟来制备扩增组织。由于扩增缓冲液的粘度，组织可能不会完全浸没。通过轻轻移液将扩增缓冲液移液到组织下方并将缓冲液排出组织顶部直至浸没，从而混合。
4. 通过在95°C下加热6μL3μM原液90秒，并在黑暗的抽屉中冷却至室温30分钟，分别制备18pM发夹h1和18pM发夹h2。确保PCR管盖紧，以防止在热循环仪中加热时发夹蒸发。
   注意：为了节省时间，可以在步骤6.4的第4^个洗涤 步骤中启动步骤6.1。发夹应单独加热，防止交叉反应。在此步骤中，发夹不应用任何缓冲液稀释。发夹可以与探头一起从探头制造商处购买。
5. 将步骤6.3中添加的扩增缓冲液替换为含有加热的发夹（来自步骤6.4）的混合物以及100μL扩增缓冲液。典型反应将包含 6 μL h1、6 μL h2 和 100 μL 扩增缓冲液。
   注意：发夹 h1 和 h2 可以在冷却至室温后合并，然后加入 100 μL 扩增缓冲液中。为了避免将组织样品从一个试管转移到另一个试管，可以去除步骤6.3中的扩增缓冲液，并用在扩增缓冲液中稀释的发夹混合物代替。
6. 孵育组织过夜，并在室温下使用章动器的默认速度在黑暗中章动。

7. 安装组织样品

1. 用 300 μL 5x SSCT（在吐温-20 中稀释的氯化钠-柠檬酸钠）稀释孵育组织中的扩增缓冲液。
   注意：稀释有助于降低粘度，并更容易从组织中去除扩增缓冲液。我们使用 Triton-X 100 进行前固定，将 Tween-20 用于后固定步骤，因为它们作为透化细胞膜的试剂的作用存在差异。
2. 在室温下用 400 μL 5x SSCT 洗涤组织 5 次。
   注意：如果需要，将组织暂时储存在4°C，直到准备好安装。我们在成像前不超过 2 天。
3. 在载玻片上制作 5 滴安装溶液。切割 200 μL 移液器吸头的吸头，使其变宽，然后将组织转移到新的载玻片上。
4. 用镊子抓住组织样本的基部，轻轻浸入并冲洗在一系列凝固溶液液滴中。注意不要在此步骤中折断组织。
5. 用安装液安装，放置盖玻片，并用指甲油密封。使用共聚焦显微镜对 原位 组织样品进行成像。

结果

按蚊天线中化学感觉基因的可靠检测
我们研究了HCR FISH方法（图1）检测蚊子嗅觉组织中化学感觉受体表达的灵敏度。在之前在雌性按蚊天线上报道的RNA转录数据的指导下，我们生成了靶向各种IR的探针。来自四项独立触角转录组研究的平均转录值显示，与共受体 Ir25a （197 RPKM） 和 Ir76b （193 RPKM^{） 相比}，Ir41t.1 （11 RPKM）、Ir75d （...

讨论

第三代杂交链式反应 （HCR） 因其灵敏度和稳健性而著称，可以可视化多个 RNA 靶标⁸。HCR WM-FISH已成功用于果蝇、鸡、小鼠和斑马鱼的胚胎以及线虫和斑马鱼的幼虫10,16,17。蚊子触角和上颌触诊通常容易出现高自发荧光和弱探针穿透，这在进行传统的全位安装方法时尤其具有挑战性。HCR方案中集成...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent