Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos

Resumo

O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.

Resumo

Os mosquitos são vetores eficazes de doenças mortais e podem navegar em seu ambiente químico usando receptores quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos. Compreender como os receptores quimiossensoriais estão organizados espacialmente nos apêndices olfativos periféricos pode oferecer insights sobre como o odor é codificado no sistema olfatório do mosquito e informar novas maneiras de combater a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos. O surgimento da hibridização de terceira geração de reação em cadeia de RNA, hibridação in situ de montagem total de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) permite o mapeamento espacial e o perfil de expressão simultânea de múltiplos genes quimiossensoriais. Aqui, descrevemos uma abordagem passo a passo para a realização do HCR RNA WM-FISH na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar. Investigamos a sensibilidade desta técnica examinando o perfil de expressão dos receptores olfatórios ionotrópicos. Perguntamos se a técnica de HCR WM-FISH descrita era adequada para estudos multiplexados por meio da ligação de sondas de RNA a três fluoróforos espectralmente distintos. Os resultados forneceram evidências de que o HCR RNA WM-FISH é robustamente sensível para detectar simultaneamente múltiplos genes quimiossensoriais na antena e apêndices olfativos palpos maxilares. Investigações posteriores atestam a adequação do HCR WM-FISH para o perfil de co-expressão de alvos de RNA duplo e triplo. Esta técnica, quando aplicada com modificações, pode ser adaptável para localizar genes de interesse nos tecidos olfativos de outras espécies de insetos ou em outros apêndices.

Introdução

Mosquitos vetores como Anopheles gambiae dependem de um rico repertório de genes quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos periféricos para prosperar em um mundo químico complexo e identificar odores comportamentalmente relevantes emanados de hospedeiros humanos, detectar fontes de néctar e localizar sítios de oviposição¹. A antena do mosquito e o palpo maxilar são enriquecidos com genes quimiossensoriais que conduzem a detecção de odor nesses apêndices olfativos. Três classes principais de canais iônicos ligados a ligantes conduzem a detecção de odor nos apêndices olfativos de mosquitos: os receptores odorantes (ORs), qu....

Protocolo

1. Considerações e preparação dos materiais

1. Decida se a montagem completa ou a criossecção do tecido serão apropriadas. Este protocolo é otimizado para imagens in situ de RNA na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar sem criossecção. Se as amostras tiverem espessura superior a 5 mm, recomenda-se a criossecção para permitir a penetração da sonda.
2. Identifique os genes de interesse e copie as sequências, incluindo íntrons e éxons de um banco de dados adequado. Transcreva a sequência gênica em RNA para síntese.
3. Determine se as sondas devem ser compradas de fornecedores comerciais ou se as sondas serão ....

Discussão

A terceira geração da reação em cadeia de hibridização (HCR) é notável por sua sensibilidade e robustez para visualizar vários alvos de^RNA8. O HCR WM-FISH tem sido utilizado com sucesso em embriões de Drosophila, galinhas, camundongos e zebrafish, bem como em larvas de nematoides e zebrafish 10,16,17. Antenas de mosquito e palpos maxilares são tipicamente propensos a alta autofluoresc?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent