Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.

Zusammenfassung

Stechmücken sind effektive Überträger tödlicher Krankheiten und können sich mit Hilfe von chemosensorischen Rezeptoren, die in ihren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, in ihrer chemischen Umgebung zurechtfinden. Das Verständnis, wie chemosensorische Rezeptoren in den peripheren olfaktorischen Anhängseln räumlich organisiert sind, kann Einblicke in die Kodierung von Gerüchen im Riechsystem von Mücken geben und neue Wege zur Bekämpfung der Ausbreitung von durch Mücken übertragenen Krankheiten aufzeigen. Das Aufkommen der dritten Generation der Hybridisierungskettenreaktions-RNA-Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) ermöglicht die räumliche Kartierung und gleichzeitige Erstellung von Expressionsprofilen mehrerer chemosensorischer Gene. Hier beschreiben wir einen schrittweisen Ansatz zur Durchführung von HCR-RNA-WM-FISH an der Anopheles-Moskitoantenne und dem Oberkieferpalp. Wir untersuchten die Sensitivität dieser Technik, indem wir das Expressionsprofil ionotroper olfaktorischer Rezeptoren untersuchten. Wir fragten, ob die beschriebene HCR WM-FISH-Technik für Multiplex-Studien geeignet ist, bei denen RNA-Sonden an drei spektral unterschiedliche Fluorophore gebunden werden. Die Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass HCR-RNA WM-FISH robust sensitiv ist, um mehrere chemosensorische Gene gleichzeitig in den olfaktorischen Anhängseln der Antenne und des Oberkiefers zu detektieren. Weitere Untersuchungen belegen die Eignung von HCR WM-FISH für das Co-Expressions-Profiling von Doppel- und Dreifach-RNA-Targets. Diese Technik könnte, wenn sie mit Modifikationen angewendet wird, anpassungsfähig sein, um Gene von Interesse im Riechgewebe anderer Insektenarten oder in anderen Anhängseln zu lokalisieren.

Einleitung

Stechmückenvektoren wie Anopheles gambiae sind auf ein reiches Repertoire an chemosensorischen Genen angewiesen, die in ihren peripheren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, um in einer komplexen chemischen Welt zu gedeihen und verhaltensrelevante Gerüche zu identifizieren, die von menschlichen Wirten ausgehen, Nektarquellen aufzuspüren und Eiablageplätze zu lokalisieren¹. Die Mückenantenne und der Oberkieferpalp sind mit chemosensorischen Genen angereichert, die die Geruchswahrnehmung in diesen olfaktorischen Anhängseln steuern. Drei Hauptklassen von ligandengesteuerten Ionenkanälen steuern die Geruchserkennung in den olfaktorischen Anhängseln von Mücken: die Geruchsrezeptoren (ORs), die mit einem obligaten Geruchsrezeptor-Co-Rezeptor (Orco) zusammenarbeiten; die ionotropen Rezeptoren (IRs), die mit einem oder mehreren IR-Corezeptoren (IR8a, IR25a und IR76b) interagieren; die chemosensorischen gustatorischen Rezeptoren (GRs), die als Komplex aus drei Proteinen zum Nachweis von Kohlendioxid (CO₂)^1,2 fungieren.

Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis der Expression endogener mRNA³. Im Allgemeinen verwendet diese Methode eine Fluorophor-markierte einzelsträngige Nukleinsäuresonde mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Ziel-mRNA ist. Die Bindung der fluoreszierenden RNA-Sonde an die Ziel-RNA ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die ein Transkript von Interesse exprimieren. Jüngste Fortschritte ermöglichen nun die Detektion von Transkripten in ganzem Mückengewebe ^4,5. Die erste Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-Technologie verwendete einen RNA-basierten HCR-Verstärker; Dies wurde in einer Methode der zweiten Generation verbessert, die stattdessen technisch hergestellte DNA für den HCR-Verstärker ^6,7 verwendete. Dieses Upgrade führte zu einer 10-fachen Steigerung des Signals, einer drastischen Senkung der Produktionskosten und einer deutlichen Verbesserung der Haltbarkeit der Reagenzien ^6,7.

In dem Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer HCR-Whole-Mount-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (HCR RNA WM-FISH) der dritten Generation, die für den Nachweis der räumlichen Lokalisierung und Expression eines beliebigen Gens entwickelt wurde ^8,9. Bei dieser zweistufigen Methode werden zunächst Nukleinsäuresonden verwendet, die für die interessierende mRNA spezifisch sind, aber auch eine Initiatorerkennungssequenz enthalten. Im zweiten Schritt werden mit Fluorophoren markierte Haarnadeln verwendet, die an die Initiatorsequenz binden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken (Abbildung 1). Dieses Verfahren ermöglicht auch das Multiplexen von zwei oder mehr RNA-Sonden und das Amplifizieren von Sondensignalen, um den RNA-Nachweis und die Quantifizierung zu erleichtern⁸. Die Visualisierung der Transkripthäufigkeit und der RNA-Lokalisierungsmuster von chemosensorischen Genen, die in den olfaktorischen Anhängen exprimiert werden, bietet den ersten Einblick in chemosensorische Genfunktionen und Geruchskodierungen.

Protokoll

1. Überlegungen und Vorbereitung der Materialien

1. Entscheiden Sie, ob ein ganzer Schnitt oder ein Kryoschnitt des Gewebes angemessen ist. Dieses Protokoll ist optimiert für die In-situ-Bildgebung von RNA in der Anopheles-Mückenantenne und im Oberkieferpalp ohne Kryoschnitt. Wenn die Proben dicker als 5 mm sind, wird ein Kryoschnitt empfohlen, um das Eindringen der Sonde zu ermöglichen.
2. Identifizieren Sie die interessierenden Gene und kopieren Sie die Sequenzen einschließlich Introns und Exons aus einer geeigneten Datenbank. Transkribieren Sie die Gensequenz in RNA für die Synthese.
3. Bestimmen Sie, ob Sie Sonden von kommerziellen Anbietern kaufen oder ob Sonden im Labor synthetisiert werden sollen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden die In-situ-Sonden von einem kommerziellen Anbieter gekauft (siehe Materialtabelle). Alternativ kann es synthetisiert werden, wie zuvor berichtet¹⁰. Die in der Studie verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 beschrieben. Die für die Herstellung der Reagenzien erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

2. Vorfixierung des Gewebes

1. Betäuben Sie 10-15 erwachsene weibliche oder männliche Anopheles coluzzii-Mücken (Stamm N'Gousso), die 5-10 Tage nach dem Schlüpfen alt sind, indem Sie sie mit einem Mundsauger in einen Pappbecher oder ein Plastikröhrchen sammeln und in einen Eimer mit Eis legen. Eine erfolgreiche Kälteanästhesie kann bestätigt werden, wenn die Mücken unbeweglich sind.
2. Enthaupte sie, indem du die Köpfe mit einer Zange aus dem Halsbereich entfernst. Greife mit der nicht-dominanten Hand den Thorax mit einer Pinzette und trenne den Hals vom Körper mit einer Pinzette, die von der dominanten Hand gehalten wird. Die Köpfe werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μl Chitinase-Chymotrypsin-Dimethylsulfoxid-Puffer (CCD-Puffer) auf Eis gelegt.
   HINWEIS: Das Einfrieren von Tieren kann die Antennen verformen. Ein schneller Knockdown auf Eis wird empfohlen. Das Alter der Mücke während des Tests kann je nach Projekt variieren. Es ist wichtig, ihren physiologischen Status zu bestätigen und zu koordinieren, z. B. ob sie mit Blut gefüttert, ausgehungert oder begattet werden. In dieser Studie wurden olfaktorische Anhängsel von Mücken entnommen, die mit Blut gefüttert und gepaart worden waren.
3. Moskitoköpfe in CCD-Puffer bei 37 °C auf einem Heizblock 5 min vorheizen und dann das Röhrchen mit den Moskitoköpfen in einen Hybridisierungsofen überführen und bei 37 °C drehen. Die Inkubationszeit im CCD-Puffer hängt vom Gewebetyp ab. Für weibliche Anopheles-Antennen 20 Minuten verwenden, männliche Antennen benötigen 15 Minuten, während für die Oberkieferpalpen eine längere Inkubationszeit (1 h) erforderlich ist.
4. Den gesamten Inhalt des Röhrchens in ein Sezieruhrglas geben. Gießen Sie die Probe vorsichtig in die Vertiefung eines Uhrenglases (Sezierglas). Wenn Moskitoköpfe im Röhrchen stecken, verwenden Sie eine Pipette, um CCD-Puffer in das Röhrchen zu geben und den Kopf auszuspülen.
5. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Köpfe oder alle Antennen/Palpen, die sich während der Inkubation abgelöst haben, vorsichtig zu übertragen und 1 ml des Präfixiermittels zu fixieren.
   HINWEIS: Übrig gebliebener CCD-Puffer kann bei -20 ° C aufbewahrt werden. Puffer kann bis zu 3x wiederverwendet werden. Wenn das Präfixiermittel aufgrund der CCD-Pufferverschleppung durch das Gewebe leicht bräunlich wird, ersetzen Sie es durch weitere 1 ml Fixiermittel.
6. Drehen Sie die Köpfe im Vorfixiermittel für 24 Stunden bei 4° C mit einem Nutator.
   HINWEIS: Die Wippgeschwindigkeit für den in dieser Studie verwendeten Nutator war nicht einstellbar; Es wurde die vom Hersteller eingestellte Standarddrehzahl (12 U/min) verwendet.

3. Gewebedissektion

1. Spülköpfe 4x (5 Minuten pro Waschgang) mit 1 ml 0,1 % PBS-Tween auf Eis spülen. Um Probenverluste zu vermeiden, verwenden Sie eine Pipette, die an der Gelladespitze befestigt ist, um die Flüssigkeit zu entfernen.
   HINWEIS: Zwei schnelle Wäschen, gefolgt von einer 10-minütigen langen Wäsche, und eine letzte Schnellwäsche kann anstelle von Schritt 3.1 durchgeführt werden.
2. Setzen Sie die Köpfe in der Röhre in ein Sezieruhrglas um. Gießen Sie die Probe vorsichtig in die Vertiefung eines Uhrenglases. Spülen Sie Mückenköpfe, die in der Röhre stecken, mit 0,1% PBS-Tween aus.
3. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop das interessierende Gewebe (Antennen/Palpen) mit einer scharfen Zange vom Kopf. Halten Sie den hinteren Teil des Kopfes mit einer Pinzette fest und greifen Sie eine Antenne mit einer anderen Pinzette von der Basis aus. Reinigen Sie die Pinzette mit Papier, das mit RNAse-freiem Lösungsmittel angefeuchtet ist. Entfernen Sie die Palps auf die gleiche Weise.
4. Übertragen Sie die Antennen und Palpen mit einer Pinzette in leere DNA/RNase-freie Röhrchen, die auf Eis gestellt werden. Trennen Sie die verschiedenen Gewebeteile in vorbeschriftete verschiedene Röhrchen.
5. Gewebe in 400 μl Lösungsmittel mit einer Mischung aus Methanol (MeOH 80%) und Dimethylsulfoxid (DMSO 20%) 1 h bei Raumtemperatur dehydrieren.
   HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, Taschentücher auf einen Nutengeber zu legen. Lassen Sie es bei Raumtemperatur auf einem Röhrchengestell auf dem Labortisch stehen. Es wird empfohlen, eine frische Lösungsmittelmischung zu verwenden. Für eine 500-μl-Stammlösung mischen Sie 400 μl MeOH mit 100 μl DMSO.
6. Ersetzen Sie das Entwässerungsreagenz durch 400 μl absolutes (100%) Methanol und dehydrieren Sie das Gewebe über Nacht bei -20 °C. Lassen Sie das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen und verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit zu entfernen.
   HINWEIS: Die Proben sind für einen längeren Zeitraum der Dehydrierung geeignet, bis zu 4 Nächte wurden ohne Signalverlust getestet.

4. Gewebe nach der Fixierung

1. Rehydrieren Sie das Gewebe in einer vierstufigen Serie von abgestuften 400 μl MeOH/PBS-Tween für 10 Minuten auf Eis. Beginnen Sie mit 75 % MeOH/25 % PBS-Tween, gefolgt von 50 % MeOH / 50 % PBS-Tween, dann 25 % MeOH / 75 % PBS-Tween und schließlich 100 % PBS-Tween.
   HINWEIS: Eine Gel-Ladespitze mit einer winzigen Öffnung kann verwendet werden, um den Puffer aus dem Röhrchen zu entfernen, um den Verlust des Gewebes zu vermeiden. Die Pufferentfernung kann unter einem Präpariermikroskop erfolgen.
2. Mit 400 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (PBS-T) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur waschen. Waschen Sie, indem Sie die Probe auf einen Nutator legen.
3. Stellen Sie eine 20 μg/ml Proteinase-K-Lösung her und inkubieren Sie sie in 400 μl Proteinase-K-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Verdünnen Sie 20 mg/ml Proteinase-K-Stamm (1000x Stammlösung), d. h. 2 μl in 2 ml 0,1% PBS-Tween. Die Reste können in einem -20°C Gefrierschrank aufbewahrt werden.
4. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung des Gewebes, indem Sie es 2x für 10 Minuten mit 400 μl 0,1% PBS-Tween waschen.
5. 400 μl des Postfixiermittels zugeben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3x waschen, 15 min pro Wäsche, mit 400 μl 0,1% PBS-Tween.

5. Hybridisierung der Sonde

1. Inkubieren Sie das Gewebe 5 Minuten lang in 400 μl Sondenhybridisierungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in den Puffer eingetaucht ist, indem Sie vorsichtig pipettieren.
2. Bereiten Sie sich auf den nächsten Schritt vor, indem Sie ein Aliquot des Sondenhybridisierungspuffers für 30 min auf 37 °C erhitzen.
3. Puffer entfernen und mit 400 μL vorgeheiztem Sonden-Hybridisierungspuffer für 30 min bei 37 °C vorhybridisieren.
4. Stellen Sie die Sondenlösung für die chemosensorischen Zielrezeptoren (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a oder Orco) her, indem Sie 8 pM Sonde hinzufügen. 8 μl 1 μM Sondenmaterial zu 500 μl vorgewärmtem Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen.
5. Entfernen Sie den vorgewärmten Sondenhybridisierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch 400 μl erhitzte Sondenlösung.
6. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 ° C für zwei Nächte auf einem Nutenator, der in einen Inkubator gestellt und unter einer Box abgedeckt ist.

6. Verstärkung der Sonde

1. Erhitzen Sie den Sondenwaschpuffer auf 37 ° C. Entfernen Sie überschüssige Sondenlösung, indem Sie das Gewebe 5x spülen, 10 min pro Waschgang, mit 400 μl Sondenwaschpuffer bei 37 ° C, im Inkubator nutieren.
   HINWEIS: Die Vorbereitungen für Schritt 6.4 können beginnen. Beachten Sie den Hinweis in Schritt 6.4.
2. Waschen Sie die Proben 2 x 5 min pro Waschgang mit 400 μl 5x Kochsalz-Natriumcitrat mit 10 % Tween-20 (SSCT) bei Raumtemperatur. Amplifikationspuffer auf Raumtemperatur auf einem Labortisch auftauen.
3. Bereiten Sie das Gewebe für die Amplifikation vor, indem Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 μl Amplifikationspuffer inkubieren. Aufgrund der Viskosität des Amplifikationspuffers kann es vorkommen, dass das Gewebe nicht vollständig untergetaucht wird. Mischen Sie, indem Sie den Amplifikationspuffer vorsichtig unter das Gewebe pipettieren und den Puffer auf dem Gewebe ausstoßen, bis sie untergetaucht sind.
4. 18 pM Hairpin h1 und 18 pM Hairpin h2 separat vorbereiten, indem 6 μl 3 μM Material 90 s lang bei 95 °C erhitzt und 30 Minuten lang in einer dunklen Schublade auf Raumtemperatur abkühlen. Stellen Sie sicher, dass die PCR-Röhrchen fest verschlossen sind, um zu verhindern, dass die Haarnadeln beim Erhitzen in einem Thermocycler verdampfen.
   HINWEIS: Um Zeit zu sparen, kann Schritt 6.4 während des 4^. Waschschritts in Schritt 6.1 gestartet werden. Haarnadeln sollten separat erhitzt werden, um Kreuzreaktionen zu vermeiden. Haarnadeln sollten in diesem Schritt nicht mit einem Puffer verdünnt werden. Die Hairpins können zusammen mit den Sonden beim Sondenhersteller erworben werden.
5. Der in Schritt 6.3 hinzugefügte Verstärkungspuffer wird durch ein Gemisch ersetzt, das die erhitzten Haarnadeln (aus Schritt 6.4) zusammen mit 100 μl Verstärkungspuffer enthält. Eine typische Reaktion enthält 6 μl h1, 6 μl h2 und 100 μl Amplifikationspuffer.
   HINWEIS: Die Haarnadeln h1 und h2 können nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur kombiniert und dann zu 100 μl Verstärkungspuffer hinzugefügt werden. Um zu vermeiden, dass die Gewebeproben von einem Röhrchen in ein anderes übertragen werden, kann der Amplifikationspuffer in Schritt 6.3 entfernt und durch das in Amplifikationspuffer verdünnte Haarnadelgemisch ersetzt werden.
6. Gewebe über Nacht inkubieren und im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der Standardgeschwindigkeit des Nutators nutieren.

7. Einbetten der Gewebeprobe

1. Verdünnen Sie den Amplifikationspuffer im inkubierten Gewebe mit 300 μl 5x SSCT (Natriumchlorid-Natriumcitrat verdünnt in Tween-20).
   HINWEIS: Die Verdünnung ist hilfreich, um die Viskosität zu verringern und erleichtert das Entfernen des Amplifikationspuffers aus dem Gewebe. Wir verwendeten Triton-X 100 für das Präfixiermittel und Tween-20 für den postfixativen Schritt, da sie sich in ihrer Wirkung als Wirkstoffe zur Permeabilisierung der Zellmembran unterscheiden.
2. Waschen Sie das Gewebe 5x mit 400 μl 5x SSCT bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Lagern Sie das Gewebe bei Bedarf vorübergehend bei 4 °C, bis es zum Befestigen bereit ist. Wir haben 2 Tage vor der Bildgebung nicht überschritten.
3. Stellen Sie 5 Tröpfchen Montagelösung auf einem Objektträger her. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipettenspitze ab, um sie breiter zu machen, und übertragen Sie das Gewebe auf einen neuen Objektträger.
4. Fassen Sie die Gewebeproben mit einer Pinzette an ihrer Basis und tauchen und spülen Sie sie vorsichtig in eine Reihe von Tröpfchen der Einbettlösung. Achten Sie darauf, das Gewebe bei diesem Schritt nicht zu brechen.
5. Mit Montagelösung montieren, Deckglas auflegen und mit Nagellack versiegeln. Abbildung von In-situ-Gewebeproben mit einem konfokalen Mikroskop.

Ergebnisse

Robuster Nachweis chemosensorischer Gene in Anopheles-Antenne
Wir untersuchten die Sensitivität der HCR FISH-Methode (Abbildung 1), um die Expression von chemosensorischen Rezeptoren in Riechgeweben von Mücken nachzuweisen. Geleitet von den RNA-Transkriptdaten, die zuvor über die weibliche Anopheles-Mückenantenne berichtet wurden, generierten wir Sonden, um eine Vielzahl von IRs anzuvisieren. Die durchschnittlichen Transkriptionswerte aus vier unabh?...

Diskussion

Die dritte Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR) zeichnet sich durch ihre Empfindlichkeit und Robustheit zur Visualisierung mehrerer RNA-Ziele aus⁸. HCR WM-FISH wurde erfolgreich bei den Embryonen von Drosophila, Hühnern, Mäusen und Zebrafischen sowie bei den Larven von Nematoden und Zebrafischen eingesetzt 10,16,17. Moskitoantennen und Oberkieferpalpen sind in der Regel anfällig ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent