Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.

Zusammenfassung

Stechmücken sind effektive Überträger tödlicher Krankheiten und können sich mit Hilfe von chemosensorischen Rezeptoren, die in ihren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, in ihrer chemischen Umgebung zurechtfinden. Das Verständnis, wie chemosensorische Rezeptoren in den peripheren olfaktorischen Anhängseln räumlich organisiert sind, kann Einblicke in die Kodierung von Gerüchen im Riechsystem von Mücken geben und neue Wege zur Bekämpfung der Ausbreitung von durch Mücken übertragenen Krankheiten aufzeigen. Das Aufkommen der dritten Generation der Hybridisierungskettenreaktions-RNA-Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) ermöglicht die räumliche Kartierung und gleichzeitige Erstellung von Expressionsprofilen mehrerer chemosensorischer Gene. Hier beschreiben wir einen schrittweisen Ansatz zur Durchführung von HCR-RNA-WM-FISH an der Anopheles-Moskitoantenne und dem Oberkieferpalp. Wir untersuchten die Sensitivität dieser Technik, indem wir das Expressionsprofil ionotroper olfaktorischer Rezeptoren untersuchten. Wir fragten, ob die beschriebene HCR WM-FISH-Technik für Multiplex-Studien geeignet ist, bei denen RNA-Sonden an drei spektral unterschiedliche Fluorophore gebunden werden. Die Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass HCR-RNA WM-FISH robust sensitiv ist, um mehrere chemosensorische Gene gleichzeitig in den olfaktorischen Anhängseln der Antenne und des Oberkiefers zu detektieren. Weitere Untersuchungen belegen die Eignung von HCR WM-FISH für das Co-Expressions-Profiling von Doppel- und Dreifach-RNA-Targets. Diese Technik könnte, wenn sie mit Modifikationen angewendet wird, anpassungsfähig sein, um Gene von Interesse im Riechgewebe anderer Insektenarten oder in anderen Anhängseln zu lokalisieren.

Einleitung

Stechmückenvektoren wie Anopheles gambiae sind auf ein reiches Repertoire an chemosensorischen Genen angewiesen, die in ihren peripheren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, um in einer komplexen chemischen Welt zu gedeihen und verhaltensrelevante Gerüche zu identifizieren, die von menschlichen Wirten ausgehen, Nektarquellen aufzuspüren und Eiablageplätze zu lokalisieren¹. Die Mückenantenne und der Oberkieferpalp sind mit chemosensorischen Genen angereichert, die die Geruchswahrnehmung in diesen olfaktorischen Anhängseln steuern. Drei Hauptklassen von ligandengesteuerten Ionenkanälen steuern die Geruchserkennung in den olfaktor....

Protokoll

1. Überlegungen und Vorbereitung der Materialien

1. Entscheiden Sie, ob ein ganzer Schnitt oder ein Kryoschnitt des Gewebes angemessen ist. Dieses Protokoll ist optimiert für die In-situ-Bildgebung von RNA in der Anopheles-Mückenantenne und im Oberkieferpalp ohne Kryoschnitt. Wenn die Proben dicker als 5 mm sind, wird ein Kryoschnitt empfohlen, um das Eindringen der Sonde zu ermöglichen.
2. Identifizieren Sie die interessierenden Gene und kopieren Sie die Sequenzen einschließlich Introns und Exons aus einer geeigneten Datenbank. Transkribieren Sie die Gensequenz in RNA für die Synthese.
3. Bestimmen Sie, ob Sie S....

Diskussion

Die dritte Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR) zeichnet sich durch ihre Empfindlichkeit und Robustheit zur Visualisierung mehrerer RNA-Ziele aus⁸. HCR WM-FISH wurde erfolgreich bei den Embryonen von Drosophila, Hühnern, Mäusen und Zebrafischen sowie bei den Larven von Nematoden und Zebrafischen eingesetzt 10,16,17. Moskitoantennen und Oberkieferpalpen sind in der Regel anfällig .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent