A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.
יתושים הם וקטורים יעילים של מחלות קטלניות ויכולים לנווט בסביבתם הכימית באמצעות קולטנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח שלהם. הבנת האופן שבו קולטנים כימו-סנסוריים מאורגנים מרחבית בתוספות הריח ההיקפיות יכולה להציע תובנות לגבי האופן שבו ריח מקודד במערכת חוש הריח של יתושים ולספק דרכים חדשות להילחם בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים. הופעתה של תגובת שרשרת הכלאה מהדור השלישי RNA פלואורסצנטי באתרו (HCR RNA, WM-FISH) מאפשרת מיפוי מרחבי ופרופיל ביטוי סימולטני של גנים כימו-סנסוריים מרובים. כאן, אנו מתארים גישה מדורגת לביצוע HCR RNA WM-FISH על אנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי. חקרנו את הרגישות של טכניקה זו על ידי בחינת פרופיל הביטוי של קולטני ריח יונוטרופיים. שאלנו אם טכניקת HCR WM-FISH שתוארה מתאימה למחקרים מרובים על ידי קשירת גשושיות RNA לשלושה פלואורופורים מובחנים ספקטרלית. התוצאות סיפקו ראיות לכך ש- HCR RNA WM-FISH רגיש מאוד לזיהוי בו זמנית של גנים כימו-סנסוריים מרובים באנטנה ובתוספות הריח של מישוש הריח המקסילרי. חקירות נוספות מעידות על התאמתו של HCR WM-FISH לפרופיל ביטוי משותף של מטרות RNA כפולות ומשולשות. טכניקה זו, כאשר מיושמת עם שינויים, יכולה להיות ניתנת להתאמה כדי למקם גנים בעלי עניין ברקמות הריח של מיני חרקים אחרים או בנספחים אחרים.
וקטורים של יתושים כגון אנופלס גמביה מסתמכים על רפרטואר עשיר של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח ההיקפיות שלהם כדי לשגשג בעולם כימי מורכב ולזהות ריחות רלוונטיים התנהגותית הנובעים מפונדקאים אנושיים, לאתר מקורות צוף ולאתר אתרי אוביפוזיציה1. אנטנת היתוש והמישוש המקסילרי מועשרים בגנים כימו-סנסוריים המניעים זיהוי ריחות בתוספות חוש הריח הללו. שלוש קבוצות עיקריות של תעלות יונים מגודרות ליגנד מניעות זיהוי ריחות בתוספות הריח של יתושים: קולטני הריח (ORs), הפועלים עם קולטן אובלנטי אובלנטי (Orco); קולטנים יונוטרופיים (IRs), אשר אינטראקציה עם קולטן IR אחד או יותר (IR8a, IR25a ו- IR76b); קולטני המשב הכימו-סנסורי (GRs), המתפקדים כקומפלקס של של....
1. שיקולים והכנת חומרים
זיהוי חזק של גנים כימו-סנסוריים באנטנת אנופלס
חקרנו את הרגישות של שיטת HCR FISH (איור 1) כדי לזהות את הביטוי של קולטנים כימו-חושיים ברקמות ריח של יתושים. בהנחיית נתוני תעתיק RNA שדווחו מוקדם יותר על אנטנת יתוש אנופלס הנקבית, יצרנו גשושיות כדי להתמקד במגוון של .......
הדור השלישי של תגובת שרשרת הכלאה (HCR) יוצא דופן ברגישותו ובחוסנו כדי לדמיין מספר מטרות RNA8. HCR WM-FISH שימש בהצלחה על עוברים של דרוזופילה, תרנגולות, עכברים ודגי זברה, כמו גם על זחלים של נמטודות ודגי זברה 10,16,17. אנטנות יתושים ומיש.......
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים למרגו הררה ולמעבדת לסלי וושל על שיתוף פרוטוקול ההכלאה באתרם עבור נספחי ריח Aedes aegypti . עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ל- C.J.P. (NIAID R01Al137078), מלגת HHMI חנה גריי ל- J.I.R, פרס מאיץ פוסט-דוקטורט של ג'ונס הופקינס ל- J.I.R, ומלגת פוסט-דוקטורט של מכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה ל- J.I.R. אנו מודים למכון לחקר המלריה בג'ונס הופקינס ולקרן בלומברג על תמיכתם.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
Methanol | Fisher | A412-500 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved