A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

Abstract

יתושים הם וקטורים יעילים של מחלות קטלניות ויכולים לנווט בסביבתם הכימית באמצעות קולטנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח שלהם. הבנת האופן שבו קולטנים כימו-סנסוריים מאורגנים מרחבית בתוספות הריח ההיקפיות יכולה להציע תובנות לגבי האופן שבו ריח מקודד במערכת חוש הריח של יתושים ולספק דרכים חדשות להילחם בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים. הופעתה של תגובת שרשרת הכלאה מהדור השלישי RNA פלואורסצנטי באתרו (HCR RNA, WM-FISH) מאפשרת מיפוי מרחבי ופרופיל ביטוי סימולטני של גנים כימו-סנסוריים מרובים. כאן, אנו מתארים גישה מדורגת לביצוע HCR RNA WM-FISH על אנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי. חקרנו את הרגישות של טכניקה זו על ידי בחינת פרופיל הביטוי של קולטני ריח יונוטרופיים. שאלנו אם טכניקת HCR WM-FISH שתוארה מתאימה למחקרים מרובים על ידי קשירת גשושיות RNA לשלושה פלואורופורים מובחנים ספקטרלית. התוצאות סיפקו ראיות לכך ש- HCR RNA WM-FISH רגיש מאוד לזיהוי בו זמנית של גנים כימו-סנסוריים מרובים באנטנה ובתוספות הריח של מישוש הריח המקסילרי. חקירות נוספות מעידות על התאמתו של HCR WM-FISH לפרופיל ביטוי משותף של מטרות RNA כפולות ומשולשות. טכניקה זו, כאשר מיושמת עם שינויים, יכולה להיות ניתנת להתאמה כדי למקם גנים בעלי עניין ברקמות הריח של מיני חרקים אחרים או בנספחים אחרים.

Introduction

וקטורים של יתושים כגון אנופלס גמביה מסתמכים על רפרטואר עשיר של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח ההיקפיות שלהם כדי לשגשג בעולם כימי מורכב ולזהות ריחות רלוונטיים התנהגותית הנובעים מפונדקאים אנושיים, לאתר מקורות צוף ולאתר אתרי אוביפוזיציה1. אנטנת היתוש והמישוש המקסילרי מועשרים בגנים כימו-סנסוריים המניעים זיהוי ריחות בתוספות חוש הריח הללו. שלוש קבוצות עיקריות של תעלות יונים מגודרות ליגנד מניעות זיהוי ריחות בתוספות הריח של יתושים: קולטני הריח (ORs), הפועלים עם קולטן אובלנטי אובלנטי (Orco); קולטנים יונוטרופיים (IRs), אשר אינטראקציה עם קולטן IR אחד או יותר (IR8a, IR25a ו- IR76b); קולטני המשב הכימו-סנסורי (GRs), המתפקדים כקומפלקס של של....

Protocol

1. שיקולים והכנת חומרים

  1. החלט אם הרכבה שלמה או הקפאה של רקמה תהיה מתאימה. פרוטוקול זה ממוטב להדמיית RNA באתרו בהרכבה מלאה באנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי ללא חתך קריו. אם הדגימות עבות יותר מ-5 מ"מ, מומלץ לבצע חתך קריו-חתך כדי לאפשר חדירה לבדיקה.
  2. לזהות את הגנים המעניינים ולהעתיק את הרצפים כולל אינטרונים ואקסונים ממסד נתונים מתאים. תעתוק רצף הגן לרנ"א לסינתזה.
  3. קבע אם לרכוש בדיקות מספקים מסחריים או אם בדיקות יסונתזו במעבדה.
    הערה: במחקר זה, הגשושיות באתרן נרכשו מספק מסחרי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לסנתז אותו כפי שדווח בעבר10. ריאגנטים ששימשו במחקר ....

תוצאות

זיהוי חזק של גנים כימו-סנסוריים באנטנת אנופלס
חקרנו את הרגישות של שיטת HCR FISH (איור 1) כדי לזהות את הביטוי של קולטנים כימו-חושיים ברקמות ריח של יתושים. בהנחיית נתוני תעתיק RNA שדווחו מוקדם יותר על אנטנת יתוש אנופלס הנקבית, יצרנו גשושיות כדי להתמקד במגוון של .......

Discussion

הדור השלישי של תגובת שרשרת הכלאה (HCR) יוצא דופן ברגישותו ובחוסנו כדי לדמיין מספר מטרות RNA8. HCR WM-FISH שימש בהצלחה על עוברים של דרוזופילה, תרנגולות, עכברים ודגי זברה, כמו גם על זחלים של נמטודות ודגי זברה 10,16,17. אנטנות יתושים ומיש.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למרגו הררה ולמעבדת לסלי וושל על שיתוף פרוטוקול ההכלאה באתרם עבור נספחי ריח Aedes aegypti . עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ל- C.J.P. (NIAID R01Al137078), מלגת HHMI חנה גריי ל- J.I.R, פרס מאיץ פוסט-דוקטורט של ג'ונס הופקינס ל- J.I.R, ומלגת פוסט-דוקטורט של מכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה ל- J.I.R. אנו מודים למכון לחקר המלריה בג'ונס הופקינס ולקרן בלומברג על תמיכתם.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplification bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitinaseSigma-AldrichC6137-50UN
ChymotrypsinSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf tubeVWR20901-5511.5 mL
ForcepsDumont11251Number 5
Gel loading tipCostar48531-200 µL tip
Hairpins Molecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescenceh1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)Sigma-AldrichH0887
IR25a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK149 AGAP010272
IR41t.1 probeMolecular Instruments Probe Set ID: PRK978AGAP004432
IR64a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK700 AGAP004923
IR75d probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK976AGAP004969
IR76b probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRI998AGAP011968
IR7t probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRL355AGAP002763
IR8a probeMolecular InstrumentsProbe Set ID: PRK150AGAP010411
LoBind TubesVWR80077-2360.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MethanolFisher A412-500
Nuclease-free waterThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModel 1353-D Mini rocker
Orco probeMolecular InstrumentsProbe set ID PRD954AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )Electron Microscopy Services 15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Probe hybridization bufferMolecular Instrumentshttps://www.molecularinstruments.com/50 mL
Probe wash bufferMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence100 mL
Proteinase-KThermo FisherAM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
SlowFade DiamondThermo Fisher S36972mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10%)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10% )TeknovaT0027
Watch glassCarolina742300 1 5/8" square; transparent

References

  1. Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
  2. Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 1....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved