תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

Summary

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

Abstract

יתושים הם וקטורים יעילים של מחלות קטלניות ויכולים לנווט בסביבתם הכימית באמצעות קולטנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח שלהם. הבנת האופן שבו קולטנים כימו-סנסוריים מאורגנים מרחבית בתוספות הריח ההיקפיות יכולה להציע תובנות לגבי האופן שבו ריח מקודד במערכת חוש הריח של יתושים ולספק דרכים חדשות להילחם בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים. הופעתה של תגובת שרשרת הכלאה מהדור השלישי RNA פלואורסצנטי באתרו (HCR RNA, WM-FISH) מאפשרת מיפוי מרחבי ופרופיל ביטוי סימולטני של גנים כימו-סנסוריים מרובים. כאן, אנו מתארים גישה מדורגת לביצוע HCR RNA WM-FISH על אנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי. חקרנו את הרגישות של טכניקה זו על ידי בחינת פרופיל הביטוי של קולטני ריח יונוטרופיים. שאלנו אם טכניקת HCR WM-FISH שתוארה מתאימה למחקרים מרובים על ידי קשירת גשושיות RNA לשלושה פלואורופורים מובחנים ספקטרלית. התוצאות סיפקו ראיות לכך ש- HCR RNA WM-FISH רגיש מאוד לזיהוי בו זמנית של גנים כימו-סנסוריים מרובים באנטנה ובתוספות הריח של מישוש הריח המקסילרי. חקירות נוספות מעידות על התאמתו של HCR WM-FISH לפרופיל ביטוי משותף של מטרות RNA כפולות ומשולשות. טכניקה זו, כאשר מיושמת עם שינויים, יכולה להיות ניתנת להתאמה כדי למקם גנים בעלי עניין ברקמות הריח של מיני חרקים אחרים או בנספחים אחרים.

Introduction

וקטורים של יתושים כגון אנופלס גמביה מסתמכים על רפרטואר עשיר של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח ההיקפיות שלהם כדי לשגשג בעולם כימי מורכב ולזהות ריחות רלוונטיים התנהגותית הנובעים מפונדקאים אנושיים, לאתר מקורות צוף ולאתר אתרי אוביפוזיציה¹. אנטנת היתוש והמישוש המקסילרי מועשרים בגנים כימו-סנסוריים המניעים זיהוי ריחות בתוספות חוש הריח הללו. שלוש קבוצות עיקריות של תעלות יונים מגודרות ליגנד מניעות זיהוי ריחות בתוספות הריח של יתושים: קולטני הריח (ORs), הפועלים עם קולטן אובלנטי אובלנטי (Orco); קולטנים יונוטרופיים (IRs), אשר אינטראקציה עם קולטן IR אחד או יותר (IR8a, IR25a ו- IR76b); קולטני המשב הכימו-סנסורי (GRs), המתפקדים כקומפלקס של שלושה חלבונים לזיהוי פחמן דו-חמצני (CO₂)^1,2.

RNA fluorescence in situ hybridization הוא כלי רב עוצמה לזיהוי ביטוי של mRNA אנדוגני³. באופן כללי, שיטה זו משתמשת בבדיקת חומצת גרעין חד-גדילית עם תיוג פלואורופור עם רצף משלים ל-mRNA מטרה. קשירה של גשושית הרנ"א הפלואורסצנטי לרנ"א המטרה מאפשרת זיהוי תאים המביעים תעתיק עניין. ההתקדמות האחרונה מאפשרת כעת זיהוי תמלילים ברקמות יתוש שלמות ^4,5. הדור הראשון של טכנולוגיית תגובת שרשרת הכלאה (HCR) השתמש במגבר HCR מבוסס RNA; זה השתפר בשיטת הדור השני שבמקום זאת השתמשה בדנ"א מהונדס עבור מגבר HCR ^6,7. שדרוג זה הביא לעלייה של פי 10 בסיגנל, ירידה דרמטית בעלות הייצור ושיפור משמעותי בעמידות של ריאגנטים ^6,7.

בפרוטוקול אנו מתארים את השימוש בשיטת הדור השלישי של HCR להכלאה מלאה של RNA באתרו (HCR RNA WM-FISH) המיועדת לאיתור לוקליזציה מרחבית וביטוי של כל גן ^8,9. שיטה דו-שלבית זו משתמשת תחילה בבדיקות חומצות גרעין ספציפיות ל-mRNA המעניין, אך מכילות גם רצף זיהוי יוזם; השלב השני משתמש בסיכות ראש עם תיוג פלואורופור שנקשרות לרצף היוזם כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי (איור 1). שיטה זו מאפשרת גם ריבוב של שתי בדיקות RNA או יותר והגברת אותות בדיקה כדי להקל על זיהוי וכימות RNA⁸. הדמיה של שפע התעתיק ודפוסי לוקליזציה של RNA של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח מציעה את הקו הראשון של תובנה לגבי תפקודי גנים כימו-סנסוריים וקידוד ריח.

Protocol

1. שיקולים והכנת חומרים

1. החלט אם הרכבה שלמה או הקפאה של רקמה תהיה מתאימה. פרוטוקול זה ממוטב להדמיית RNA באתרו בהרכבה מלאה באנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי ללא חתך קריו. אם הדגימות עבות יותר מ-5 מ"מ, מומלץ לבצע חתך קריו-חתך כדי לאפשר חדירה לבדיקה.
2. לזהות את הגנים המעניינים ולהעתיק את הרצפים כולל אינטרונים ואקסונים ממסד נתונים מתאים. תעתוק רצף הגן לרנ"א לסינתזה.
3. קבע אם לרכוש בדיקות מספקים מסחריים או אם בדיקות יסונתזו במעבדה.
   הערה: במחקר זה, הגשושיות באתרן נרכשו מספק מסחרי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לסנתז אותו כפי שדווח בעבר¹⁰. ריאגנטים ששימשו במחקר מתוארים בטבלה 1. החומרים הדרושים להכנת הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.

2. קיבוע מראש רקמות

1. מרדימים 10-15 יתושי אנופלס קולוצי בוגרים (זן N'Gousso), בגילאי 5-10 ימים לאחר הופעתם, על ידי איסופם עם שואב פה לתוך נייר או צינור פלסטיק והנחתם בדלי המכיל קרח. ניתן לאשר הרדמה מוצלחת הנגרמת על ידי הצטננות כאשר היתושים אינם ניידים.
2. ערפו את ראשיהם על ידי הסרת הראשים מאזור הצוואר בעזרת זוג מלקחיים. בעזרת היד הלא דומיננטית תופסים את בית החזה במלקחיים ומפרידים את הצוואר מהגוף בעזרת מלקחיים המוחזקים על ידי היד הדומיננטית. הניחו את הראשים בצינור של 1.5 מ"ל המכיל 500 מיקרוליטר של חיץ צ'יטינאז-כימוטריפסין דימתיל סולפוקסיד (חיץ CCD) על קרח.
   הערה: הקפאת בעלי חיים יכולה לעוות את האנטנות; מומלץ להפיל במהירות על הקרח. גילו של היתוש במהלך הבדיקה עשוי להשתנות בהתאם לפרויקט. חשוב לאשר ולתאם את מצבם הפיזיולוגי, כגון האם הם ניזונים מדם, מורעבים או מזדווגים. במחקר זה נדגמו נספחי ריח מיתושים שניזונו מדם והזדווגו.
3. לפני חימום ראשי יתושים בחיץ CCD ב 37 ° C על בלוק חום במשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר את הצינור המכיל את ראשי היתושים לתנור הכלאה ולסובב ב 37 ° C. זמן הדגירה במאגר CCD תלוי בסוג הרקמה. עבור אנטנות אנופלס נקביות, השתמש 20 דקות, אנטנות זכריות דורשות 15 דקות, בעוד זמן דגירה ארוך יותר (1 שעות) נדרש עבור palps מקסילרי.
4. העבירו את כל תכולת הצינור לזכוכית שעון מנתח. מזגו בעדינות דגימה לתוך שקע זכוכית השעון (דיסקציה). אם ראשי יתושים תקועים בתוך הצינור, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף חיץ CCD לתוך הצינור ולשטוף את הראש.
5. השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את הראשים או כל אנטנה / palps מנותק במהלך הדגירה ולתקן 1 מ"ל של pre-fixative.
   הערה: ניתן לשמר מאגר CCD שאריות ב -20 ° C. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר עד פי 3. אם pre-fixative הופך מעט חום בגלל חיץ CCD לשאת על ידי הרקמות, להחליף אותו עם עוד 1 מ"ל של קיבוע.
6. סובבו את הראשים בקיבוע מראש במשך 24 שעות ב-4°C באמצעות נוטטור.
   הערה: מהירות הנדנוד של הנוטטור ששימש במחקר זה לא הייתה ניתנת לכוונון; נעשה שימוש במהירות ברירת המחדל שנקבעה (12 סל"ד) על-ידי היצרן.

3. דיסקציה של רקמות

1. יש לשטוף את הראשים 4 פעמים (5 דקות בכל שטיפה) עם 1 מ"ל של 0.1% PBS-Tween על קרח. כדי למנוע אובדן דגימה, השתמש פיפטה מחובר קצה העמסת ג'ל כדי להסיר את הנוזל.
   הערה: ניתן לבצע שתי שטיפות מהירות ולאחריהן שטיפה באורך 10 דקות, ושטיפה מהירה סופית במקום שלב 3.1.
2. מעבירים את הראשים שבצינור לזכוכית שעון מנתח. מזגו בעדינות דגימה לתוך שקע של שעון. שטפו ראשי יתושים שתקועים בתוך הצינור עם 0.1% PBS-Tween.
3. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר רקמות מעניינות (אנטנות/פאלפס) מהראש בעזרת מלקחיים חדים. החזק את החלק האחורי של הראש עם מלקחיים ותפוס אנטנה עם מלקחיים נוספת מהבסיס. נקו מלקחיים עם נייר טבול בממס נטול RNAse. הסר את palps באמצעות אותו תהליך.
4. העבירו את האנטנות ואת המשטחים בעזרת מלקחיים לצינורות ריקים נטולי DNA/RNase המונחים על קרח. הפרידו את חלקי הרקמה השונים לצינורות שונים שסומנו מראש.
5. יש לייבש רקמה ב-400 מיקרוליטר של ממס המכיל תערובת של מתנול (MeOH 80%) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO 20%) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   הערה: אין צורך להניח רקמה על nutator; הניחו לו לשבת על מדף צינורות בטמפרטורת החדר על ספסל המעבדה. מומלץ להשתמש בתערובת ממס טרי. לקבלת תמיסת מלאי של 500 μL, ערבבו 400 μL של MeOH עם 100 μL של DMSO.
6. החלף את מגיב התייבשות עם 400 μL של מתנול מוחלט (100%) ולייבש רקמות לילה ב -20 ° C. לאפשר לרקמות להתיישב על ידי כוח הכבידה ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את הנוזל.
   הערה: דגימות הן קיימא לתקופה ממושכת של התייבשות, עד 4 לילות נבדקו ללא אובדן אות.

4. רקמה לאחר קיבוע

1. החזירו לחות לרקמות בסדרה בת ארבעה שלבים של MeOH/PBS-Tween מדורג של 400 μL למשך 10 דקות על קרח. התחל עם 75% MeOH/25% PBS-Tween ואחריו 50% MeOH / 50% PBS-Tween, לאחר מכן 25% MeOH / 75% PBS-Tween ולבסוף 100% PBS-Tween.
   הערה: ניתן להשתמש בקצה העמסת ג'ל עם פתח זעיר כדי להסיר את החיץ מהצינור כדי למנוע אובדן הרקמות. הסרת חיץ יכולה להיעשות תחת מיקרוסקופ ניתוח.
2. יש לשטוף עם 400 μL של מלח חוצץ פוספט המכיל 0.1% Tween-20 (PBS-T) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף על ידי הנחת המדגם על nutator.
3. הכינו תמיסת פרוטאינאז-K של 20 מיקרוגרם/מ"ל ודגרו על תמיסת פרוטאינאז-K של 400 מיקרוליטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: לדלל 20 מ"ג / מ"ל מלאי Proteinase-K (1000x תמיסת מלאי) כלומר, 2 μL ב 2 מ"ל של 0.1% PBS-Tween. את השאריות ניתן לאחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס.
4. עצור עיכול אנזימטי של רקמות על ידי שטיפה 2x במשך 10 דקות עם 400 μL של 0.1% PBS-tween.
5. מוסיפים 400 μL של הפוסט-קיבוע ודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. יש לכבס 3 פעמים, 15 דקות בכל כביסה, עם 400 מיקרוליטר של 0.1% PBS-Tween.

5. הכלאה של בדיקה

1. לדגור על רקמה ב 400 μL של חיץ הכלאת בדיקה במשך 5 דקות. ודא שהרקמה שקועה לחלוטין במאגר על ידי פיפטוף עדין.
2. היכונו לשלב הבא על ידי חימום aliquot של חיץ הכלאה בדיקה ל 37 ° C במשך 30 דקות.
3. הסר את החיץ וקדם הכלאה עם 400 μL של חיץ הכלאה בדיקה מחומם מראש למשך 30 דקות ב 37 ° C.
4. צור פתרון בדיקה עבור קולטני המטרה הכימו-סנסוריים (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a או Orco) על ידי הוספת 8 pM של בדיקה. הוסף 8 μL של מלאי בדיקה 1 μM למאגר הכלאה של בדיקה מחומם מראש של 500 μL.
5. הסר את חיץ הכלאת הגשושית שחומם מראש והחלף אותו בתמיסת בדיקה מחוממת של 400 מיקרוליטר.
6. רקמת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שני לילות על nutator ממוקם בתוך אינקובטור מכוסה תחת קופסה.

6. הגברה של בדיקה

1. חממו את מאגר שטיפת הבדיקה ל -37 מעלות צלזיוס. הסר תמיסת בדיקה עודפת על ידי שטיפת הרקמה 5x, 10 דקות לכל כביסה, עם 400 μL של חיץ שטיפת בדיקה ב 37 מעלות צלזיוס, אגוז באינקובטור.
   הערה: ההכנה לשלב 6.4 עשויה להתחיל. ראה את ההערה בשלב 6.4.
2. יש לשטוף דוגמיות 2x, 5 דקות בכל כביסה, עם 400 μL של 5x מלוחים-נתרן ציטראט המכילים 10% Tween-20 (SSCT) בטמפרטורת החדר. הפשירו את חיץ ההגברה לטמפרטורת החדר על גבי ספסל.
3. מכינים את הרקמה להגברה על ידי דגירה עם 400 מיקרוליטר של חיץ הגברה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בשל צמיגות חיץ ההגברה, רקמות לא יכול להיות שקוע לחלוטין. מערבבים על ידי פיטום עדין של חיץ ההגברה מתחת לרקמה והוצאת החיץ על גבי הרקמה עד שהם שקועים.
4. הכינו בנפרד 18 pM של סיכת ראש h1 ו-18pM של סיכת ראש h2 על ידי חימום 6 μL של 3 μM ב-95°C למשך 90 שניות וצננו לטמפרטורת החדר במגירה חשוכה למשך 30 דקות. ודא שצינורות ה-PCR מכוסים היטב כדי למנוע אידוי של סיכות השיער בזמן חימום במחזור תרמי.
   הערה: כדי לחסוך זמן, ניתן להתחיל את שלב 6.4 בשלב^הכביסה הרביעי בשלב 6.1. יש לחמם את סיכות השיער בנפרד כדי למנוע תגובה צולבת. אין לדלל סיכות שיער עם כל חיץ בשלב זה. את סיכות הראש ניתן לרכוש מיצרן הגשושית יחד עם הגשושיות.
5. החלף את מאגר ההגברה שנוסף בשלב 6.3 בתערובת המכילה את סיכות השיער המחוממות (משלב 6.4) יחד עם 100 μL של חיץ הגברה. תגובה טיפוסית תכיל 6 μL של h1, 6 μL של h2, ו-100 μL של חיץ הגברה.
   הערה: ניתן לשלב את סיכות השיער h1 ו-h2 לאחר קירור לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף אותן ל-100 μL של חיץ הגברה. כדי להימנע מהעברת דגימות הרקמה מצינור אחד למשנהו, ניתן להסיר את חיץ ההגברה בשלב 6.3 ולהחליפו בתערובת סיכות השיער המדוללות במאגר הגברה.
6. יש לדגור על רקמה למשך הלילה ולאגוז בחושך בטמפרטורת החדר באמצעות מהירות ברירת המחדל של המזין.

7. דגימת רקמה הרכבה

1. חיץ הגברה מדולל ברקמה המודגרת עם 300 μL של 5x SSCT (נתרן כלורי-נתרן ציטראט מדולל ב- Tween-20).
   הערה: הדילול עוזר להפחית את הצמיגות ומקל על הסרת חיץ ההגברה מהרקמה. השתמשנו ב-Triton-X 100 עבור השלב שלפני הקיבוע וב-Tween-20 עבור השלב שלאחר הקיבוע בגלל ההבדלים בפעולות שלהם כסוכנים לחדירת קרום התא.
2. יש לשטוף רקמות 5x עם 400 μL של 5x SSCT בטמפרטורת החדר.
   הערה: יש לאחסן את הרקמה באופן זמני בטמפרטורה של 4°C עד להרכבה מוכנה להרכבה, במידת הצורך. לא חרגנו מיומיים לפני ההדמיה.
3. הכינו 5 טיפות של תמיסת הרכבה על מגלשת זכוכית. חתכו את קצה קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר כדי להרחיב אותו והעבירו את הרקמה למגלשת זכוכית חדשה.
4. תפוס את דגימות הרקמה בבסיסן במלקחיים וטבול ושטוף בעדינות בסדרה של טיפות תמיסת הרכבה. היזהר לא לשבור את הרקמות בשלב זה.
5. הרכבה עם תמיסת הרכבה, יש להניח את הכיסוי ולאטום עם לק. תמונה באתרו דגימות רקמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

זיהוי חזק של גנים כימו-סנסוריים באנטנת אנופלס
חקרנו את הרגישות של שיטת HCR FISH (איור 1) כדי לזהות את הביטוי של קולטנים כימו-חושיים ברקמות ריח של יתושים. בהנחיית נתוני תעתיק RNA שדווחו מוקדם יותר על אנטנת יתוש אנופלס הנקבית, יצרנו גשושיות כדי להתמקד במגוון של ...

Discussion

הדור השלישי של תגובת שרשרת הכלאה (HCR) יוצא דופן ברגישותו ובחוסנו כדי לדמיין מספר מטרות RNA⁸. HCR WM-FISH שימש בהצלחה על עוברים של דרוזופילה, תרנגולות, עכברים ודגי זברה, כמו גם על זחלים של נמטודות ודגי זברה 10,16,17. אנטנות יתושים ומיש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent