Hybridation Réaction en chaîne ARN Fluorescence intégrale Hybridation in situ de gènes chimiosensoriels dans les appendices olfactifs des moustiques

Résumé

L’article décrit les méthodes et les réactifs nécessaires pour effectuer l’hybridation de l’hybridation de l’ARN en fluorescence sur montage entier (HCR ARN, WM-FISH) afin de révéler des informations sur la résolution spatiale et cellulaire des gènes des récepteurs chimiosensoriels dans l’antenne du moustique et le palpe maxillaire.

Résumé

Les moustiques sont des vecteurs efficaces de maladies mortelles et peuvent naviguer dans leur environnement chimique à l’aide de récepteurs chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs. Comprendre comment les récepteurs chimiosensoriels sont organisés spatialement dans les appendices olfactifs périphériques peut offrir des informations sur la façon dont l’odeur est codée dans le système olfactif des moustiques et éclairer de nouvelles façons de lutter contre la propagation des maladies transmises par les moustiques. L’émergence de l’hybridation in situ de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) permet une cartographie spatiale et un profilage simultané de l’expression de plusieurs gènes chimiosensoriels. Ici, nous décrivons une approche par étapes pour effectuer l’ARN HCR WM-FISH sur l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire. Nous avons étudié la sensibilité de cette technique en examinant le profil d’expression des récepteurs olfactifs ionotropiques. Nous avons demandé si la technique HCR WM-FISH décrite était adaptée aux études multiplexées en attachant des sondes d’ARN à trois fluorophores spectralement distincts. Les résultats ont fourni la preuve que l’ARN HCR WM-FISH est robuste pour détecter simultanément plusieurs gènes chimiosensoriels dans l’antenne et les appendices olfactifs des palpes maxillaires. D’autres études attestent de l’adéquation de HCR WM-FISH pour le profilage de co-expression de cibles à ARN double et triple. Cette technique, lorsqu’elle est appliquée avec des modifications, pourrait être adaptable pour localiser des gènes d’intérêt dans les tissus olfactifs d’autres espèces d’insectes ou dans d’autres appendices.

Introduction

Les moustiques vecteurs tels que Anopheles gambiae s’appuient sur un riche répertoire de gènes chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs périphériques pour prospérer dans un monde chimique complexe et identifier les odeurs comportementales pertinentes émanant d’hôtes humains, détecter les sources de nectar et localiser les sites de ponte¹. L’antenne du moustique et le palpe maxillaire sont enrichis de gènes chimiosensoriels qui pilotent la détection des odeurs dans ces appendices olfactifs. Trois classes principales de canaux ioniques ligand-dépendants pilotent la détection des odeurs dans les appendices olfactifs des moustiques : les récepteurs odorants (OR), qui fonctionnent avec un corécepteur obligatoire des récepteurs odorants (Orco) ; les récepteurs ionotropiques (IR), qui interagissent avec un ou plusieurs corécepteurs IR (IR8a, IR25a et IR76b) ; les récepteurs gustatifs chimiosensoriels (GRs), qui fonctionnent comme un complexe de trois protéines pour détecter le dioxyde de carbone (CO₂)^1,2.

L’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN est un outil puissant pour détecter l’expression de l’ARNm³ endogène. En général, cette méthode utilise une sonde d’acide nucléique simple brin marquée au fluorophore avec une séquence complémentaire à un ARNm cible. La liaison de la sonde d’ARN fluorescent à l’ARN cible permet d’identifier les cellules exprimant un transcrit d’intérêt. Des progrès récents permettent maintenant la détection de transcrits dans des tissus de moustiques entiers ^4,5. La première génération de la technologie de réaction en chaîne par hybridation (HCR) utilisait un amplificateur HCR à base d’ARN ; cela a été amélioré dans une méthode de deuxième génération qui a plutôt utilisé de l’ADN artificiel pour l’amplificateur HCR ^6,7. Cette mise à niveau s’est traduite par une multiplication par 10 du signal, une diminution spectaculaire des coûts de production et une amélioration significative de la durabilité des réactifs ^6,7.

Dans le protocole, nous décrivons l’utilisation d’une méthode d’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à montage entier HCR de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) conçue pour détecter la localisation spatiale et l’expression de tout gène ^8,9. Cette méthode en deux étapes utilise d’abord des sondes d’acides nucléiques spécifiques à l’ARNm d’intérêt, mais qui contiennent également une séquence de reconnaissance de l’initiateur ; la deuxième étape utilise des épingles à cheveux marquées au fluorophore qui se lient à la séquence d’initiateur pour amplifier le signal fluorescent (Figure 1). Cette méthode permet également le multiplexage de deux ou plusieurs sondes d’ARN et l’amplification des signaux de sonde pour faciliter la détection et la quantification de l’ARN⁸. La visualisation de l’abondance des transcrits et des modèles de localisation de l’ARN des gènes chimiosensoriels exprimés dans les appendices olfactifs offre la première ligne de compréhension des fonctions des gènes chimiosensoriels et du codage des odeurs.

Protocole

1. Considérations et préparation du matériel

1. Décidez si le montage complet ou la cryo-section du tissu sera approprié. Ce protocole est optimisé pour l’imagerie in situ de l’ARN dans l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire sans cryo-section. Si les échantillons ont une épaisseur supérieure à 5 mm, il est recommandé de procéder à une cryo-section pour permettre la pénétration de la sonde.
2. Identifiez les gènes d’intérêt et copiez les séquences, y compris les introns et les exons, à partir d’une base de données appropriée. Transcrire la séquence du gène en ARN pour la synthèse.
3. Déterminez s’il faut acheter des sondes auprès de fournisseurs commerciaux ou si les sondes seront synthétisées en laboratoire.
   NOTA : Dans le cadre de la présente étude, les sondes in situ ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux). Alternativement, il peut être synthétisé comme indiqué précédemment¹⁰. Les réactifs utilisés dans l’étude sont décrits dans le tableau 1. Les matériaux nécessaires à la préparation des réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

2. Pré-fixation tissulaire

1. Anesthésier 10 à 15 moustiques adultes femelles ou mâles Anopheles coluzzii (souche N’Gousso), âgés de 5 à 10 jours après la levée, en les recueillant à l’aide d’un aspirateur buccal dans un gobelet en papier ou un tube en plastique et en les plaçant dans un seau contenant de la glace. Une anesthésie induite par le froid réussie peut être confirmée lorsque les moustiques sont immobiles.
2. Décapitaz-les en enlevant les têtes de la région du cou avec une paire de pinces. À l’aide de la main non dominante, saisissez le thorax avec une pince et séparez le cou du corps avec une pince tenue par la main dominante. Placer les têtes dans un tube de 1,5 mL contenant 500 μL de tampon chitinase-chymotrypsine diméthylsulfoxyde (tampon CCD) sur de la glace.
   REMARQUE : La congélation des animaux peut déformer les antennes ; Un knockdown rapide sur la glace est recommandé. L’âge du moustique pendant les tests peut varier en fonction du projet. Il est important de confirmer et de coordonner leur état physiologique, par exemple s’ils sont nourris au sang, affamés ou accouplés. Dans cette étude, des appendices olfactifs ont été prélevés sur des moustiques nourris au sang et accouplés.
3. Préchauffer les têtes de moustiques dans un tampon CCD à 37 ° C sur un bloc chauffant pendant 5 min, puis transférer le tube contenant les têtes de moustiques dans un four d’hybridation et tourner à 37 ° C. Le temps d’incubation dans le tampon CCD dépend du type de tissu. Pour les antennes d’anophèles femelles, utilisez 20 min, les antennes mâles nécessitent 15 min, tandis qu’un temps d’incubation plus long (1 h) est nécessaire pour les palpes maxillaires.
4. Transférez tout le contenu du tube dans un verre de montre à dissection. Versez doucement l’échantillon dans la dépression d’un verre de montre (dissection). Si des têtes de moustiques sont coincées à l’intérieur du tube, utilisez une pipette pour ajouter un tampon CCD dans le tube et rincez la tête.
5. À l’aide d’une pince, transférez soigneusement les têtes ou les antennes/palpes détachés pendant l’incubation et fixez-les dans 1 mL du préfixateur.
   REMARQUE : Le tampon CCD restant peut être conservé à -20 ° C. Le tampon peut être réutilisé jusqu’à 3 fois. Si le préfixateur devient légèrement brunâtre en raison du transfert du tampon CCD par les tissus, remplacez-le par 1 mL de fixateur supplémentaire.
6. Faire tourner les têtes dans le préfixateur pendant 24 h à 4° C à l’aide d’un nutateur.
   REMARQUE : La vitesse de bascule du nutateur utilisé dans cette étude n’était pas réglable ; La vitesse par défaut réglée (12 tr/min) par le fabricant a été utilisée.

3. Dissection tissulaire

1. Rincer les têtes 4 fois (5 min par lavage) avec 1 mL de PBS-Tween à 0,1 % sur glace. Pour éviter la perte d’échantillon, utilisez une pipette fixée à l’embout de chargement du gel pour retirer le liquide.
   REMARQUE : Deux lavages rapides suivis d’un lavage long de 10 minutes et d’un lavage rapide final peuvent être effectués à la place de l’étape 3.1.
2. Transférez les têtes dans le tube dans un verre de montre à disséquer. Versez doucement l’échantillon dans la dépression d’un verre de montre. Rincez les têtes de moustiques coincées à l’intérieur du tube avec 0,1 % de PBS-Tween.
3. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez les tissus d’intérêt (antennes/palpes) de la tête à l’aide d’une pince tranchante. Tenez la partie postérieure de la tête avec une pince et saisissez une antenne avec une autre pince à la base. Nettoyez la pince avec du papier imbibé de solvant sans ARNase. Retirez les palpes en utilisant le même processus.
4. Transférez les antennes et les palpes à l’aide d’une pince dans des tubes vides exempts d’ADN/RNase placés sur de la glace. Séparez les différentes parties du tissu dans différents tubes pré-étiquetés.
5. Déshydrater le tissu dans 400 μL de solvant contenant un mélange de méthanol (MeOH 80%) et de diméthylsulfoxyde (DMSO 20%) pendant 1 h à température ambiante.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de placer du tissu sur un nutateur ; Laissez-le reposer sur un support de tubes à température ambiante sur la paillasse du laboratoire. Il est recommandé d’utiliser un mélange de solvants frais. Pour une solution mère de 500 μL, mélanger 400 μL de MeOH avec 100 μL de DMSO.
6. Remplacer le réactif déshydratant par 400 μL de méthanol absolu (100 %) et déshydrater les tissus pendant une nuit à -20 °C. Laissez les tissus se déposer par gravité et utilisez une pipette pour retirer le liquide.
   REMARQUE : Les échantillons sont viables pour une période prolongée de déshydratation, jusqu’à 4 nuits ont été testées sans perte de signal.

4. Post-fixation tissulaire

1. Réhydrater les tissus en quatre étapes de 400 μL MeOH/PBS-Tween pendant 10 minutes sur de la glace. Commencez par 75 % de MeOH/25 % PBS-Tween, suivis de 50 % de MeOH/50 % PBS-Tween, puis de 25 % de MeOH/75 % PBS-Tween et enfin de 100 % de PBS-Tween.
   REMARQUE : Un embout de chargement de gel avec une petite ouverture peut être utilisé pour retirer le tampon du tube afin d’éviter de perdre les tissus. L’élimination du tampon peut être effectuée sous un microscope à dissection.
2. Laver avec 400 μL de solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1 % Tween-20 (PBS-T) pendant 10 minutes à température ambiante. Laver en plaçant l’échantillon sur un nutateur.
3. Préparer une solution de 20 μg/mL de protéinase K et incuber dans 400 μL de solution de protéinase K pendant 30 min à température ambiante.
   NOTA : Diluer 20 mg/mL de protéinase K (solution mère 1000x), c’est-à-dire 2 μL dans 2 mL de PBS-Tween à 0,1 %. Le reste peut être conservé dans un congélateur à -20°C.
4. Arrêtez la digestion enzymatique des tissus en les lavant 2 fois pendant 10 min avec 400 μL de PBS-tween à 0,1 %.
5. Ajouter 400 μL de post-fixateur et incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 fois, 15 min par lavage, avec 400 μL de PBS-Tween à 0,1 %.

5. Hybridation de la sonde

1. Incuber le tissu dans 400 μL de tampon d’hybridation de sonde pendant 5 min. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé dans le tampon en pipetant doucement.
2. Préparez-vous à l’étape suivante en chauffant une aliquote de tampon d’hybridation de sonde à 37°C pendant 30 min.
3. Retirer le tampon et pré-hybrider avec 400 μL de tampon d’hybridation de sonde préchauffé pendant 30 min à 37°C.
4. Faire une solution de sonde pour les récepteurs chimiosensoriels cibles (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a ou Orco) en ajoutant 8 pM de sonde. Ajouter 8 μL de sonde de 1 μM à un tampon d’hybridation de sonde préchauffée de 500 μL.
5. Retirez le tampon d’hybridation de sonde préchauffé et remplacez-le par 400 μL de solution de sonde chauffée.
6. Incuber les tissus à 37°C pendant deux nuits sur un nutator placé à l’intérieur d’un incubateur et recouvert sous une boîte.

6. Amplification de la sonde

1. Chauffer le tampon de lavage de la sonde à 37 ° C. Éliminer l’excès de solution de la sonde en rinçant le tissu 5x, 10 min par lavage, avec 400 μL de tampon de lavage de la sonde à 37 ° C, nutation dans l’incubateur.
   REMARQUE : La préparation de l’étape 6.4 peut commencer. Reportez-vous à la remarque de l’étape 6.4.
2. Laver les échantillons 2 fois, 5 minutes par lavage, avec 400 μL de citrate de sodium salin 5x contenant 10 % de Tween-20 (SSCT) à température ambiante. Décongeler le tampon d’amplification à température ambiante sur une paillasse.
3. Préparer les tissus pour l’amplification en les incubant avec 400 μL de tampon d’amplification pendant 10 min à température ambiante. En raison de la viscosité du tampon d’amplification, les tissus peuvent ne pas être complètement submergés. Mélangez en pipetant doucement le tampon d’amplification sous le tissu et en expulsant le tampon sur le dessus du tissu jusqu’à ce qu’il soit submergé.
4. Préparer séparément 18 pM d’épingle à cheveux h1 et 18 pM d’épingle h2 en chauffant 6 μL de papier 3 μM à 95 °C pendant 90 s et en refroidissant à température ambiante dans un tiroir sombre pendant 30 min. Assurez-vous que les tubes PCR sont bien bouchés pour éviter l’évaporation des épingles à cheveux pendant le chauffage dans un thermocycleur.
   REMARQUE : Pour gagner du temps, l’étape 6.4 peut être lancée lors de la^4e étape de lavage de l’étape 6.1. Les épingles à cheveux doivent être chauffées séparément pour éviter toute réaction croisée. Les épingles à cheveux ne doivent pas être diluées avec un tampon à cette étape. Les épingles à cheveux peuvent être achetées auprès du fabricant de la sonde avec les sondes.
5. Remplacez le tampon d’amplification ajouté à l’étape 6.3 par un mélange contenant les épingles à cheveux chauffées (à partir de l’étape 6.4) ainsi que 100 μL de tampon d’amplification. Une réaction typique contiendra 6 μL de h1, 6 μL de h2 et 100 μL de tampon d’amplification.
   REMARQUE : Les épingles à cheveux h1 et h2 peuvent être combinées après refroidissement à température ambiante, puis ajoutées à 100 μL de tampon d’amplification. Pour éviter de transférer les échantillons de tissus d’un tube à l’autre, le tampon d’amplification de l’étape 6.3 peut être retiré et remplacé par le mélange d’épingles à cheveux dilué dans le tampon d’amplification.
6. Incubez les tissus pendant la nuit et nutez dans l’obscurité à température ambiante en utilisant la vitesse par défaut du nutateur.

7. Échantillon de tissu de montage

1. Diluer le tampon d’amplification dans le tissu incubé avec 300 μL de SSCT 5x (chlorure de sodium-citrate de sodium dilué dans Tween-20).
   REMARQUE : La dilution est utile pour réduire la viscosité et facilite l’élimination du tampon d’amplification du tissu. Nous avons utilisé Triton-X 100 pour le pré-fixateur et Tween-20 pour l’étape post-fixatrice en raison des différences dans leurs actions en tant qu’agents pour perméabiliser la membrane cellulaire.
2. Laver le papier hygiénique 5 fois avec 400 μL de SSCT 5x à température ambiante.
   REMARQUE : Conservez temporairement les mouchoirs en papier à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être montés, si nécessaire. Nous n’avons pas dépassé 2 jours avant l’imagerie.
3. Faites 5 gouttelettes de solution de montage sur une lame de verre. Coupez l’embout d’une pipette de 200 μL pour l’élargir et transférez le tissu sur une nouvelle lame de verre.
4. Saisissez les échantillons de tissus par leur base à l’aide d’une pince et plongez-les doucement et rincez-les dans une série de gouttelettes de solution de montage. Veillez à ne pas casser les tissus lors de cette étape.
5. Montez avec une solution de montage, placez la lamelle et scellez avec du vernis à ongles. Imager des échantillons de tissus in situ à l’aide d’un microscope confocal.

Résultats

Détection robuste des gènes chimiosensoriels dans l’antenne de l’anophèle
Nous avons étudié la sensibilité de la méthode HCR FISH (Figure 1) pour détecter l’expression des récepteurs chimiosensoriels dans les tissus olfactifs des moustiques. Guidés par les données de transcription de l’ARN rapportées précédemment sur l’antenne femelle du moustique anophèle, nous avons généré des sondes pour cibler une variété d’IR. Les val...

Discussion

La troisième génération de réaction en chaîne d’hybridation (HCR) est remarquable par sa sensibilité et sa robustesse pour visualiser plusieurs cibles d’ARN⁸. HCR WM-FISH a été utilisé avec succès sur les embryons de drosophile, de poulet, de souris et de poisson-zèbre ainsi que sur les larves de nématodes et de poissons-zèbres 10,16,17. Les antennes de moustiques et les palpes m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent