Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos

Resumen

El artículo describe los métodos y reactivos necesarios para realizar la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación (HCR RNA WM-FISH) para revelar información sobre la resolución espacial y celular de los genes receptores quimiosensoriales en la antena del mosquito y el palpo maxilar.

Resumen

Los mosquitos son vectores eficaces de enfermedades mortales y pueden navegar por su entorno químico utilizando receptores quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos. Comprender cómo se organizan espacialmente los receptores quimiosensoriales en los apéndices olfativos periféricos puede ofrecer información sobre cómo se codifica el olor en el sistema olfativo de los mosquitos e informar nuevas formas de combatir la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos. La aparición de la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) permite el mapeo espacial y el perfil de expresión simultánea de múltiples genes quimiosensoriales. Aquí, describimos un enfoque paso a paso para realizar HCR RNA WM-FISH en la antena del mosquito Anopheles y el palpo maxilar. Investigamos la sensibilidad de esta técnica examinando el perfil de expresión de los receptores olfativos ionotrópicos. Preguntamos si la técnica HCR WM-FISH descrita era adecuada para estudios multiplexados mediante la conexión de sondas de ARN a tres fluoróforos espectralmente distintos. Los resultados proporcionaron evidencia de que HCR RNA WM-FISH es robustamente sensible para detectar simultáneamente múltiples genes quimiosensoriales en la antena y los apéndices olfativos palpes maxilares. Investigaciones posteriores atestiguan la idoneidad de HCR WM-FISH para el perfil de coexpresión de dianas de ARN dobles y triples. Esta técnica, cuando se aplica con modificaciones, podría ser adaptable para localizar genes de interés en los tejidos olfativos de otras especies de insectos o en otros apéndices.

Introducción

Los mosquitos vectores como Anopheles gambiae dependen de un rico repertorio de genes quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos periféricos para prosperar en un mundo químico complejo e identificar olores relevantes para el comportamiento que emanan de huéspedes humanos, detectar fuentes de néctar y^{localizar sitios de} oviposición. La antena del mosquito y el palpo maxilar están enriquecidos con genes quimiosensoriales que impulsan la detección de olores en estos apéndices olfativos. Tres clases principales de canales iónicos activados por ligandos impulsan la detección de olores en los apéndices olfativos de los mosquitos....

Protocolo

1. Consideraciones y preparación de los materiales

1. Decida si el montaje completo o la criosección de tejido serán apropiados. Este protocolo está optimizado para la obtención de imágenes in situ de montaje completo de ARN en la antena del mosquito Anopheles y el palpo maxilar sin crioseccionamiento. Si las muestras tienen un grosor superior a 5 mm, se recomienda crioseccionar para permitir la penetración de la sonda.
2. Identificar los genes de interés y copiar las secuencias, incluidos los intrones y los exones, de una base de datos adecuada. Transcribir la secuencia génica en ARN para su síntesis.
3. Determi....

Discusión

La tercera generación de reacción en cadena de hibridación (HCR) destaca por su sensibilidad y robustez para visualizar varias dianas de ARN⁸. HCR WM-FISH se ha utilizado con éxito en embriones de Drosophila, pollo, ratones y pez cebra, así como en larvas de nematodos y pez cebra 10,16,17. Las antenas de los mosquitos y los palpos maxilares suelen ser propensos a una alta autofluorescencia y.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent