Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos

Resumen

El artículo describe los métodos y reactivos necesarios para realizar la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación (HCR RNA WM-FISH) para revelar información sobre la resolución espacial y celular de los genes receptores quimiosensoriales en la antena del mosquito y el palpo maxilar.

Resumen

Los mosquitos son vectores eficaces de enfermedades mortales y pueden navegar por su entorno químico utilizando receptores quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos. Comprender cómo se organizan espacialmente los receptores quimiosensoriales en los apéndices olfativos periféricos puede ofrecer información sobre cómo se codifica el olor en el sistema olfativo de los mosquitos e informar nuevas formas de combatir la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos. La aparición de la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) permite el mapeo espacial y el perfil de expresión simultánea de múltiples genes quimiosensoriales. Aquí, describimos un enfoque paso a paso para realizar HCR RNA WM-FISH en la antena del mosquito Anopheles y el palpo maxilar. Investigamos la sensibilidad de esta técnica examinando el perfil de expresión de los receptores olfativos ionotrópicos. Preguntamos si la técnica HCR WM-FISH descrita era adecuada para estudios multiplexados mediante la conexión de sondas de ARN a tres fluoróforos espectralmente distintos. Los resultados proporcionaron evidencia de que HCR RNA WM-FISH es robustamente sensible para detectar simultáneamente múltiples genes quimiosensoriales en la antena y los apéndices olfativos palpes maxilares. Investigaciones posteriores atestiguan la idoneidad de HCR WM-FISH para el perfil de coexpresión de dianas de ARN dobles y triples. Esta técnica, cuando se aplica con modificaciones, podría ser adaptable para localizar genes de interés en los tejidos olfativos de otras especies de insectos o en otros apéndices.

Introducción

Los mosquitos vectores como Anopheles gambiae dependen de un rico repertorio de genes quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos periféricos para prosperar en un mundo químico complejo e identificar olores relevantes para el comportamiento que emanan de huéspedes humanos, detectar fuentes de néctar y^{localizar sitios de} oviposición. La antena del mosquito y el palpo maxilar están enriquecidos con genes quimiosensoriales que impulsan la detección de olores en estos apéndices olfativos. Tres clases principales de canales iónicos activados por ligandos impulsan la detección de olores en los apéndices olfativos de los mosquitos: los receptores de olores (OR), que funcionan con un correceptor de olores obligado (Orco); los receptores ionotrópicos (IR), que interactúan con uno o más correceptores IR (IR8a, IR25a e IR76b); los receptores gustativos quimiosensoriales (GR), que funcionan como un complejo de tres proteínas para detectar el dióxido de carbono (CO₂)^1,2.

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN es una poderosa herramienta para detectar la expresión de ARNm endógeno³. En general, este método utiliza una sonda de ácido nucleico monocatenario marcada con fluoróforos con secuencia complementaria a un ARNm diana. La unión de la sonda de ARN fluorescente al ARN diana permite la identificación de células que expresan una transcripción de interés. Los avances recientes permiten ahora la detección de transcripciones en tejidos de mosquitos de monte entero ^4,5. La primera generación de tecnología de reacción en cadena de hibridación (HCR) utilizaba un amplificador HCR basado en ARN; esto se mejoró en un método de segunda generación que, en cambio, utilizó ADN diseñado para el amplificador HCR ^6,7. Esta actualización dio como resultado un aumento de 10 veces en la señal, una disminución drástica en el costo de producción y una mejora significativa en la durabilidad de los reactivos ^6,7.

En el protocolo, describimos la utilización de un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN de montaje completo HCR de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) diseñado para detectar la localización espacial y la expresión de cualquier gen ^8,9. Este método de dos pasos utiliza primero sondas de ácido nucleico específicas para el ARNm de interés, pero que también contienen una secuencia de reconocimiento del iniciador; el segundo paso utiliza horquillas marcadas con fluoróforos que se unen a la secuencia del iniciador para amplificar la señal fluorescente (Figura 1). Este método también permite la multiplexación de dos o más sondas de ARN y la amplificación de las señales de la sonda para facilitar la detección y cuantificación del ARN⁸. La visualización de la abundancia de transcripciones y los patrones de localización del ARN de los genes quimiosensoriales expresados en los apéndices olfativos ofrece la primera línea de información sobre las funciones de los genes quimiosensoriales y la codificación de los olores.

Protocolo

1. Consideraciones y preparación de los materiales

1. Decida si el montaje completo o la criosección de tejido serán apropiados. Este protocolo está optimizado para la obtención de imágenes in situ de montaje completo de ARN en la antena del mosquito Anopheles y el palpo maxilar sin crioseccionamiento. Si las muestras tienen un grosor superior a 5 mm, se recomienda crioseccionar para permitir la penetración de la sonda.
2. Identificar los genes de interés y copiar las secuencias, incluidos los intrones y los exones, de una base de datos adecuada. Transcribir la secuencia génica en ARN para su síntesis.
3. Determine si debe comprar sondas de proveedores comerciales o si las sondas se sintetizarán en el laboratorio.
   NOTA: En este estudio, las sondas in situ se compraron a un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales). Alternativamente, se puede sintetizar como se informó anteriormente¹⁰. Los reactivos utilizados en el estudio se describen en la Tabla 1. Los materiales necesarios para preparar los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.

2. Prefijación tisular

1. Anestesiar de 10 a 15 mosquitos Anopheles coluzzii hembra o macho adultos (cepa N'Gousso), de 5 a 10 días después de la emergencia, recogiéndolos con un aspirador bucal en un vaso de papel o tubo de plástico y colocándolos en un balde que contenga hielo. Se puede confirmar el éxito de la anestesia inducida por el frío cuando los mosquitos están inmóviles.
2. Decapitarlos quitando las cabezas de la región del cuello con un par de fórceps. Con la mano no dominante, agarre el tórax con fórceps y separe el cuello del cuerpo con fórceps sostenido por la mano dominante. Coloque las cabezas en un tubo de 1,5 ml que contenga 500 μl de tampón dimetilsulfóxido de quitinasa-quimotripsina (tampón CCD) sobre hielo.
   NOTA: La congelación de los animales puede deformar las antenas; Se recomienda un derribo rápido sobre hielo. La edad del mosquito durante la prueba puede variar según el proyecto. Es importante confirmar y coordinar su estado fisiológico, por ejemplo, si se alimentan con sangre, si están hambrientos o si se aparean. En este estudio, se tomaron muestras de apéndices olfativos de mosquitos que habían sido alimentados con sangre y apareados.
3. Precaliente las cabezas de mosquitos en un tampón CCD a 37 ° C en un bloque de calor durante 5 minutos y luego transfiera el tubo que contiene las cabezas de mosquitos a un horno de hibridación y gire a 37 ° C. El tiempo de incubación en el tampón CCD depende del tipo de tejido. Para las antenas femeninas de Anopheles , usar 20 min, las antenas masculinas requieren 15 min, mientras que se necesita un tiempo de incubación más largo (1 h) para los palpos maxilares.
4. Transfiera todo el contenido del tubo a un vidrio de reloj de disección. Vierta suavemente la muestra en la depresión del cristal de un reloj (disección). Si las cabezas de mosquitos están atascadas dentro del tubo, use una pipeta para agregar un tampón CCD en el tubo y enjuague la cabeza.
5. Utilice fórceps para transferir con cuidado las cabezas o las antenas/palpos desprendidos durante la incubación y fíjelos en 1 ml del prefijador.
   NOTA: El tampón CCD sobrante se puede conservar a -20 ° C. El tampón se puede reutilizar hasta 3 veces. Si el prefijador se vuelve ligeramente marrón debido al arrastre de tampón CCD por los tejidos, reemplácelo con otro 1 ml de fijador.
6. Gire los cabezales en prefijador durante 24 h a 4 ° C con un nutator.
   NOTA: La velocidad de balanceo del nutator utilizado en este estudio no era ajustable; Se utilizó la velocidad predeterminada establecida (12 rpm) por el fabricante.

3. Disección de tejidos

1. Enjuague los cabezales 4 veces (5 minutos por lavado) con 1 ml de 0,1% de PBS-Tween en hielo. Para evitar la pérdida de muestras, utilice una pipeta conectada a la punta de carga de gel para eliminar el líquido.
   NOTA: Se pueden realizar dos lavados rápidos seguidos de un lavado de 10 minutos de duración y un lavado rápido final en lugar del paso 3.1.
2. Transfiera las cabezas en el tubo a un vidrio de reloj de disección. Vierta suavemente la muestra en la depresión del cristal de un reloj. Enjuague las cabezas de mosquitos que estén atascadas dentro del tubo con 0.1% de PBS-Tween.
3. Bajo un microscopio de disección, extraiga los tejidos de interés (antenas/palpos) de la cabeza con pinzas afiladas. Sostenga la parte posterior de la cabeza con fórceps y agarre una antena con otra pinza de la base. Pinzas limpias con papel humedecido con disolvente libre de ARNasa. Retira los palpos con el mismo proceso.
4. Transfiera las antenas y los palpos con fórceps a tubos vacíos libres de ADN/RNasa colocados en hielo. Separe las diferentes partes del tejido en diferentes tubos preetiquetados.
5. Deshidratar el tejido en 400 μL de disolvente que contenga una mezcla de metanol (MeOH 80%) y dimetilsulfóxido (DMSO 20%) durante 1 h a temperatura ambiente.
   NOTA: No es necesario colocar pañuelos de papel en un nutator; Déjalo reposar en una rejilla de tubos a temperatura ambiente en la mesa del laboratorio. Se recomienda utilizar una mezcla de disolventes frescos. Para una solución madre de 500 μL, mezcle 400 μL de MeOH con 100 μL de DMSO.
6. Sustituir el reactivo deshidratante por 400 μL de metanol absoluto (100%) y deshidratar los tejidos durante la noche a -20 °C. Deje que los tejidos se asienten por gravedad y use una pipeta para eliminar el líquido.
   NOTA: Las muestras son viables para un período prolongado de deshidratación, se han analizado hasta 4 noches sin pérdida de señal.

4. Post-fijación tisular

1. Rehidrate los tejidos en una serie de cuatro pasos de 400 μL de MeOH/PBS-Tween graduada durante 10 minutos en hielo. Comience con 75 % de MeOH / 25 % de PBS-Tween, seguido de 50 % de MeOH / 50 % de PBS-Tween, luego 25 % de MeOH / 75 % de PBS-Tween y finalmente 100 % de PBS-Tween.
   NOTA: Se puede usar una punta de carga de gel con una pequeña abertura para quitar el tampón del tubo y evitar la pérdida de los tejidos. La eliminación del tampón se puede realizar bajo un microscopio de disección.
2. Lavar con 400 μL de solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% de Tween-20 (PBS-T) durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar colocando la muestra en un nutator.
3. Preparar una solución de 20 μg/ml de proteinasa-K e incubar en 400 μl de solución de proteinasa-K durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Diluir 20 mg/ml de caldo de proteinasa-K (solución madre 1000x), es decir, 2 μl en 2 ml de PBS-Tween al 0,1%. El sobrante se puede almacenar en un congelador a -20 ° C.
4. Detenga la digestión enzimática de los tejidos lavando 2 veces durante 10 minutos con 400 μL de 0,1% de PBS-tween.
5. Añadir 400 μL del postfijador e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces, 15 min por lavado, con 400 μL de 0,1% PBS-Tween.

5. Hibridación de sondas

1. Incubar el tejido en 400 μL de tampón de hibridación de sonda durante 5 min. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en el tampón pipeteando suavemente.
2. Prepárese para el siguiente paso calentando una alícuota de tampón de hibridación de sonda a 37 ° C durante 30 min.
3. Retire el tampón y prehibrida con 400 μL de tampón de hibridación de sonda precalentada durante 30 min a 37 ° C.
4. Haga la solución de la sonda para los receptores quimiosensoriales diana (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a u Orco) añadiendo 8 pM de sonda. Agregue 8 μL de material de sonda de 1 μM a 500 μL de tampón de hibridación de sonda precalentado.
5. Retire el tampón de hibridación de la sonda precalentada y reemplácelo con 400 μL de solución de sonda calentada.
6. Incubar tejido a 37 ° C durante dos noches en un nutator colocado dentro de una incubadora y cubierto debajo de una caja.

6. Amplificación de la sonda

1. Calentar el tampón de lavado de la sonda a 37 ° C. Eliminar el exceso de solución de la sonda enjuagando el tejido 5 veces, 10 min por lavado, con 400 μL de tampón de lavado de la sonda a 37 ° C, nutando en la incubadora.
   NOTA: Es posible que comience la preparación para el paso 6.4. Consulte la nota en el paso 6.4.
2. Lave las muestras 2 veces, 5 min por lavado, con 400 μL de citrato salino-sódico 5x que contenga un 10% de Tween-20 (SSCT) a temperatura ambiente. Descongele el tampón de amplificación a temperatura ambiente en una mesa de trabajo.
3. Prepare el tejido para la amplificación incubando con 400 μL de tampón de amplificación durante 10 min a temperatura ambiente. Debido a la viscosidad del tampón de amplificación, es posible que los tejidos no estén completamente sumergidos. Mezcle pipeteando suavemente el tampón de amplificación debajo del tejido y expulsando el tampón sobre el tejido hasta que se sumerja.
4. Preparar por separado 18 pM de horquilla h1 y 18 pM de horquilla h2 calentando 6 μL de caldo de 3 μM a 95 °C durante 90 s y enfriar a temperatura ambiente en un cajón oscuro durante 30 min. Asegúrese de que los tubos de PCR estén bien tapados para evitar la evaporación de las horquillas mientras se calientan en un termociclador.
   NOTA: Para ahorrar tiempo, el paso 6.4 se puede iniciar en el^4º paso de lavado en el paso 6.1. Las horquillas deben calentarse por separado para evitar reacciones cruzadas. Las horquillas no deben diluirse con ningún tampón en este paso. Las horquillas se pueden comprar al fabricante de la sonda junto con las sondas.
5. Sustituya el tampón de amplificación añadido en el paso 6.3 por una mezcla que contenga las horquillas calentadas (del paso 6.4) junto con 100 μL de tampón de amplificación. Una reacción típica contendrá 6 μL de h1, 6 μL de h2 y 100 μL de tampón de amplificación.
   NOTA: Las horquillas h1 y h2 se pueden combinar después de enfriar a temperatura ambiente y luego agregarse a 100 μL de tampón de amplificación. Para evitar la transferencia de las muestras de tejido de un tubo a otro, el tampón de amplificación del paso 6.3 puede extraerse y sustituirse por la mezcla de horquillas diluida en tampón de amplificación.
6. Incubar el tejido durante la noche y nutar en la oscuridad a temperatura ambiente utilizando la velocidad predeterminada del nutator.

7. Montaje de la muestra de tejido

1. Diluir tampón de amplificación en el tejido incubado con 300 μL de SSCT 5x (cloruro de sodio-citrato de sodio diluido en Tween-20).
   NOTA: La dilución es útil para reducir la viscosidad y facilita la eliminación del tampón de amplificación del tejido. Se utilizó Triton-X 100 para el paso prefijador y Tween-20 para el paso postfijador debido a las diferencias en sus acciones como agentes permeabilizantes de la membrana celular.
2. Lave el pañuelo 5 veces con 400 μL de 5 SSCT a temperatura ambiente.
   NOTA: Almacene el pañuelo temporalmente a 4 °C hasta que esté listo para ser montado, si es necesario. No hemos superado los 2 días antes de la imagen.
3. Haga 5 gotas de solución de montaje en un portaobjetos de vidrio. Corte la punta de una punta de pipeta de 200 μL para hacerla más ancha y transfiera el tejido a un nuevo portaobjetos de vidrio.
4. Tome las muestras de tejido por su base con pinzas y sumérjalas y enjuague suavemente en una serie de gotas de solución de montaje. Tenga cuidado de no romper los tejidos en este paso.
5. Móntelo con una solución de montaje, coloque el cubreobjetos y selle con esmalte de uñas. Obtención de imágenes in situ de muestras de tejido utilizando un microscopio confocal.

Resultados

Detección robusta de genes quimiosensoriales en la antena de Anopheles
Investigamos la sensibilidad del método HCR FISH (Figura 1) para detectar la expresión de receptores quimiosensoriales en tejidos olfativos de mosquitos. Guiados por los datos de transcripción de ARN informados anteriormente en la antena del mosquito hembra de Anopheles, generamos sondas para apuntar a una variedad de IR. Los valores promedio de transcripción de cuatro estudios i...

Discusión

La tercera generación de reacción en cadena de hibridación (HCR) destaca por su sensibilidad y robustez para visualizar varias dianas de ARN⁸. HCR WM-FISH se ha utilizado con éxito en embriones de Drosophila, pollo, ratones y pez cebra, así como en larvas de nematodos y pez cebra 10,16,17. Las antenas de los mosquitos y los palpos maxilares suelen ser propensos a una alta autofluorescencia y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent