Reazione a catena di ibridazione RNA Fluorescenza a montaggio intero Ibridazione in situ di geni chemiosensoriali nelle appendici olfattive delle zanzare

Riepilogo

L'articolo descrive i metodi e i reagenti necessari per eseguire la reazione a catena di ibridazione RNA a fluorescenza intera in situ (HCR, RNA, WM-FISH) per rivelare informazioni sulla risoluzione spaziale e cellulare dei geni dei recettori chemiosensoriali nell'antenna della zanzara e nel palpo mascellare.

Abstract

Le zanzare sono vettori efficaci di malattie mortali e possono navigare nel loro ambiente chimico utilizzando recettori chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive. Capire come i recettori chemiosensoriali sono organizzati spazialmente nelle appendici olfattive periferiche può offrire informazioni su come l'odore è codificato nel sistema olfattivo delle zanzare e informare nuovi modi per combattere la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare. L'emergere della reazione a catena di ibridazione di terza generazione, l'ibridazione in situ dell'RNA a fluorescenza a montaggio intero (HCR, RNA, WM-FISH) consente la mappatura spaziale e la profilazione simultanea dell'espressione di più geni chemiosensoriali. Qui, descriviamo un approccio graduale per l'esecuzione dell'HCR RNA WM-FISH sull'antenna della zanzara Anopheles e sul palpo mascellare. Abbiamo studiato la sensibilità di questa tecnica esaminando il profilo di espressione dei recettori olfattivi ionotropici. Abbiamo chiesto se la tecnica HCR WM-FISH descritta fosse adatta per studi multiplexati legando sonde di RNA a tre fluorofori spettralmente distinti. I risultati hanno fornito la prova che HCR RNA WM-FISH è robustamente sensibile per rilevare simultaneamente più geni chemiosensoriali nell'antenna e nelle appendici olfattive palpi mascellari. Ulteriori indagini attestano l'idoneità di HCR WM-FISH per la profilazione di co-espressione di bersagli a doppio e triplo RNA. Questa tecnica, se applicata con modifiche, potrebbe essere adattabile per localizzare geni di interesse nei tessuti olfattivi di altre specie di insetti o in altre appendici.

Introduzione

Le zanzare vettori come Anopheles gambiae si basano su un ricco repertorio di geni chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive periferiche per prosperare in un mondo chimico complesso e identificare odori rilevanti dal punto di vista comportamentale provenienti da ospiti umani, rilevare fonti di nettare e localizzare^{siti di} ovideposizione. L'antenna della zanzara e il palpo mascellare sono arricchiti con geni chemiosensoriali che guidano il rilevamento degli odori in queste appendici olfattive. Tre classi principali di canali ionici ligando-dipendenti guidano il rilevamento degli odori nelle appendici olfattive delle zanza....

Protocollo

1. Considerazioni e preparazione dei materiali

1. Decidi se sarà appropriato l'intero montaggio o la criosezione del tessuto. Questo protocollo è ottimizzato per l'imaging in situ dell'RNA nell'antenna antizanzara Anopheles e nel palp mascellare senza criosezionamento. Se i campioni sono più spessi di 5 mm, si consiglia la criosezione per consentire la penetrazione della sonda.
2. Identificare i geni di interesse e copiare le sequenze, inclusi introni ed esoni, da un database adatto. Trascrivere la sequenza genica in RNA per la sintesi.
3. Determinare se acquistare sonde da fornitori commerciali o se le sonde ver....

Discussione

La terza generazione di reazione a catena di ibridazione (HCR) è notevole per la sua sensibilità e robustezza nel visualizzare diversi bersagli di RNA⁸. HCR WM-FISH è stato utilizzato con successo su embrioni di Drosophila, polli, topi e zebrafish, nonché sulle larve di nematodi e zebrafish 10,16,17. Le antenne delle zanzare e i palpi mascellari sono in genere soggetti a un'elevata autofluore.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent