Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,

Özet

Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.

Özet

Sivrisinekler ölümcül hastalıkların etkili vektörleridir ve koku alma eklerinde eksprese edilen kemosensör reseptörlerini kullanarak kimyasal çevrelerinde gezinebilirler. Kemosensoriyel reseptörlerin periferik koku alma eklerinde uzamsal olarak nasıl organize edildiğini anlamak, sivrisinek koku alma sisteminde kokunun nasıl kodlandığına dair içgörüler sunabilir ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasıyla mücadele etmenin yeni yollarını bilgilendirebilir. Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun (HCR RNA WM-FISH) ortaya çıkışı, çoklu kemosensoriyel genlerin uzamsal haritalanmasına ve eşzamanlı ekspresyon profiline izin verir. Burada, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp üzerinde HCR RNA WM-FISH gerçekleştirmek için aşamalı bir yaklaşım açıklıyoruz. Bu tekniğin duyarlılığını, iyonotropik koku alma reseptörlerinin ekspresyon profilini inceleyerek araştırdık. Tarif edilen HCR WM-FISH tekniğinin, RNA problarını spektral olarak farklı üç florofora bağlayarak çoğullanmış çalışmalar için uygun olup olmadığını sorduk. Sonuçlar, HCR RNA WM-FISH'in anten ve maksiller palp koku alma uzantılarındaki çoklu kemosensör genleri aynı anda tespit etmek için sağlam bir şekilde duyarlı olduğuna dair kanıt sağladı. Daha ileri araştırmalar, HCR WM-FISH'in ikili ve üçlü RNA hedeflerinin birlikte ekspresyon profilinin çıkarılması için uygunluğunu doğrulamaktadır. Bu teknik, modifikasyonlarla uygulandığında, diğer böcek türlerinin koku alma dokularında veya diğer uzantılarda ilgilenilen genleri lokalize etmek için uyarlanabilir.

Giriş

Anopheles gambiae gibi sivrisinek vektörleri, karmaşık bir kimyasal dünyada gelişmek ve insan konakçılardan yayılan davranışsal olarak ilgili kokuları tanımlamak, nektar kaynaklarını tespit etmek ve yumurtlama bölgelerini bulmak için periferik koku uzantılarında ifade edilen zengin bir kemosensör gen repertuarına güvenir¹. Sivrisinek anteni ve maksiller palp, bu koku uzantılarında koku algılamayı sağlayan kemosensör genlerle zenginleştirilmiştir. Üç ana ligand kapılı iyon kanalı sınıfı, sivrisineklerin koku alma uzantılarında koku algılamayı sağlar: zorunlu bir Koku reseptörü ko-reseptörü (Orco) ile işlev gören Koku reseptörleri (OR'ler); bir veya daha fazla IR koreseptörü (IR8a, IR25a ve IR76b) ile etkileşime giren İyonotropik reseptörler (IR'ler); karbondioksiti (CO₂) tespit etmek için üç proteinden oluşan bir kompleks olarak işlev gören kemosensoriyel Tat reseptörleri (GR'ler)^1,2.

RNA floresansı in situ hibridizasyon, endojen mRNA^3'ün ekspresyonunu tespit etmek için güçlü bir araçtır. Genel olarak, bu yöntem, bir hedef mRNA'yı tamamlayıcı diziye sahip florofor etiketli tek sarmallı bir nükleik asit probu kullanır. Floresan RNA probunun hedef RNA'ya bağlanması, ilgilenilen bir transkripti ifade eden hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Son gelişmeler artık tam monteli sivrisinek dokularında^{transkriptlerin} saptanmasını mümkün kılmaktadır ^4,5. Birinci nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) teknolojisi, RNA tabanlı bir HCR amplifikatörü kullandı; bu, bunun yerine HCR amplifikatörü ^6,7 için tasarlanmış DNA'yı kullanan ikinci nesil bir yöntemle geliştirildi. Bu yükseltme, sinyalde 10 kat artış, üretim maliyetinde dramatik bir düşüş ve^{reaktiflerin dayanıklılığında önemli bir iyileşme ile sonuçlandı 6,7}.

Protokolde, herhangi bir genin^uzamsal lokalizasyonunu ve ekspresyonunu tespit etmek için tasarlanmış üçüncü nesil HCR tam montajlı RNA floresan in situ hibridizasyon (HCR RNA WM-FISH) yönteminin kullanımını açıklıyoruz ^8,9. Bu iki aşamalı yöntem ilk olarak, ilgilenilen mRNA'ya özgü, ancak aynı zamanda bir başlatıcı tanıma dizisi içeren nükleik asit problarını kullanır; ikinci adım, floresan sinyalini yükseltmek için başlatıcı dizisine bağlanan florofor etiketli saç tokalarını kullanır (Şekil 1). Bu yöntem aynı zamanda iki veya daha fazla RNA probunun çoğullanmasına ve RNA tespitini ve nicelemeyi kolaylaştırmak için prob sinyallerinin yükseltilmesine^{izin verir 8}. Koku eklerinde eksprese edilen kemosensör genlerin transkript bolluğu ve RNA lokalizasyon modellerini görselleştirmek, kemosensoriyel gen fonksiyonları ve koku kodlaması hakkında ilk içgörü satırını sunar.

Protokol

1. Dikkat edilmesi gerekenler ve materyallerin hazırlanması

1. Dokunun tam montajının mı yoksa kriyo kesitinin mi uygun olacağına karar verin. Bu protokol, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp'taki RNA'nın kriyo-kesit olmadan tam montajlı in situ görüntülenmesi için optimize edilmiştir. Numuneler 5 mm'den daha kalınsa, prob penetrasyonunu sağlamak için kriyo-kesit alınması önerilir.
2. İlgilenilen genleri tanımlayın ve intronlar ve ekzonlar dahil olmak üzere dizileri uygun bir veritabanından kopyalayın. Sentez için gen dizisini RNA'ya kopyalayın.
3. Probların ticari satıcılardan satın alınıp alınmayacağını veya probların laboratuvarda sentezlenip sentezlenmeyeceğini belirleyin.
   NOT: Bu çalışmada, in situ problar ticari bir satıcıdan satın alınmıştır (bkz. Alternatif olarak, daha önce bildirildiği gibi^{sentezlenebilir 10}. Çalışmada kullanılan reaktifler Tablo 1'de açıklanmıştır. Reaktifleri hazırlamak için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

2. Doku ön fiksasyonu

1. Yaşları 5-10 gün arasında değişen 10-15 adet erişkin dişi veya erkek Anopheles coluzzii sivrisineğini (N'Gousso suşu) ağız aspiratörü ile bir kağıt bardağa veya plastik tüpe toplayıp içinde buz bulunan bir kovaya koyarak uyuşturun. Sivrisinekler hareketsiz olduğunda başarılı bir soğuk kaynaklı anestezi doğrulanabilir.
2. Bir çift forseps ile boyun bölgesinden kafaları çıkararak başlarını ayırın. Baskın olmayan eli kullanarak göğüs kafesini forseps ile kavrayın ve baskın elin tuttuğu forseps ile boynu vücuttan ayırın. Kafaları buz üzerinde 500 μL kitinaz-kimotripsin dimetil sülfoksit tamponu (CCD tamponu) içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
   NOT: Donan hayvanlar antenleri deforme edebilir; Buz üzerinde hızlı bir şekilde devrilmesi önerilir. Test sırasında sivrisineğin yaşı projeye bağlı olarak değişebilir. Kanla beslenip beslenmedikleri, aç bırakılıp bırakılmadıkları veya çiftleşip çiftleşmedikleri gibi fizyolojik durumlarını doğrulamak ve koordine etmek önemlidir. Bu çalışmada, kanla beslenen ve çiftleşen sivrisineklerden koku uzantıları örneklendi.
3. Sivrisinek kafalarını CCD tamponunda 37 ° C'de bir ısı bloğunda 5 dakika önceden ısıtın ve ardından sivrisinek başlıklarını içeren tüpü bir hibridizasyon fırınına aktarın ve 37 ° C'de döndürün CCD tamponunda inkübasyon süresi doku tipine bağlıdır. Dişi Anofel antenleri için 20 dakika, erkek antenler 15 dakika gerektirirken, maksiller palplar için daha uzun inkübasyon süresi (1 saat) gerekir.
4. Tüpün tüm içeriğini diseksiyon yapan bir saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat (diseksiyon) camının çöküntüsüne dökün. Sivrisinek kafaları tüpün içine sıkışmışsa, tüpe CCD tamponu eklemek için bir pipet kullanın ve kafayı durulayın.
5. İnkübasyon sırasında ayrılan kafaları veya herhangi bir anteni/avuç içini dikkatlice aktarmak için forseps kullanın ve ön fiksatifin 1 mL'sine sabitleyin.
   NOT: Artık CCD tamponu -20 ° C'de korunabilir, tampon 3x'e kadar tekrar kullanılabilir. Ön fiksatif, dokular tarafından CCD tamponunun taşınması nedeniyle hafif kahverengimsi hale gelirse, başka bir 1 mL fiksatif ile değiştirin.
6. Bir nutatör kullanarak kafaları 24 saat boyunca 4°C'de ön fiksatifte döndürün.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan nutator için sallanma hızı ayarlanamamıştır; Üretici tarafından ayarlanan varsayılan hız (12 rpm) kullanıldı.

3. Doku diseksiyonu

1. Başlıkları 4x (yıkama başına 5 dakika) buz üzerinde 1 mL %0.1 PBS-Tween ile durulayın. Numune kaybını önlemek için, sıvıyı çıkarmak için jel yükleme ucuna bağlı bir pipet kullanın.
   NOT: Adım 3.1 yerine iki hızlı yıkama, ardından 10 dakika uzunluğunda yıkama ve son bir hızlı yıkama gerçekleştirilebilir.
2. Tüpteki kafaları bir diseksiyon saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat camının çöküntüsüne dökün. Tüpün içine sıkışmış sivrisinek başlıklarını %0.1 PBS-Tween ile durulayın.
3. Diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen dokuları (antenler / avuç içleri) keskin forseps ile kafadan çıkarın. Başın arka kısmını forseps ile tutun ve tabandan başka bir forseps ile bir anten alın. Forsepsleri RNAse içermeyen çözücü ile nemlendirilmiş kağıtla temizleyin. Aynı işlemi kullanarak avuç içlerini çıkarın.
4. Antenleri ve avuç içlerini forseps ile buz üzerine yerleştirilmiş boş DNA/RNaz içermeyen tüplere aktarın. Farklı doku parçalarını önceden etiketlenmiş farklı tüplere ayırın.
5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca metanol (MeOH% 80) ve Dimetil sülfoksit (DMSO% 20) karışımı içeren 400 μL çözücü içinde dokuyu kurutun.
   NOT: Bir nutatör üzerine doku yerleştirmeye gerek yoktur; Laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında bir tüp rafına oturmasına izin verin. Taze solvent karışımı kullanılması tavsiye edilir. 500 μL'lik bir stok çözeltisi için 400 μL MeOH'yi 100 μL DMSO ile karıştırın.
6. Dehidrasyon reaktifini 400 μL mutlak (%100) metanol ile değiştirin ve dokuları gece boyunca -20 °C'de kurutun. Dokuların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın.
   NOT: Numuneler uzun süreli dehidrasyon için uygundur, sinyal kaybı olmadan 4 geceye kadar test edilmiştir.

4. Doku sonrası fiksasyon

1. Dokuları dört aşamalı bir dizi dereceli 400 μL MeOH / PBS-Tween'de buz üzerinde 10 dakika boyunca rehidre edin. %75 MeOH/%25 PBS-Tween ile başlayın, ardından %50 MeOH/%50 PBS-Tween, ardından %25 MeOH/%75 PBS-Tween ve son olarak %100 PBS-Tween ile başlayın.
   NOT: Dokuları kaybetmemek için tamponu tüpten çıkarmak için küçük bir açıklığa sahip bir jel yükleme ucu kullanılabilir. Tampon çıkarma işlemi diseksiyon mikroskobu altında yapılabilir.
2. %0,1 Tween-20 (PBS-T) içeren 400 μL fosfat tamponlu salin ile oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın. Numuneyi bir nutatör üzerine yerleştirerek yıkayın.
3. 20 μg/mL Proteinaz-K çözeltisi yapın ve 400 μL Proteinaz-K çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   NOT: 20 mg / mL Proteinaz-K stoğunu (1000x stok çözeltisi) seyreltin, yani 2 mL% 0.1 PBS-Tween'de 2 μL. Kalan -20 ° C'lik bir dondurucuda saklanabilir.
4. 400 μL% 0.1 PBS-tween ile 10 dakika boyunca 2x yıkayarak dokunun enzimatik sindirimini durdurun.
5. 400 μL post-fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 400 μL %0,1 PBS-Tween ile yıkama başına 3 kez, 15 dakika yıkayın.

5. Prob hibridizasyonu,

1. Dokuyu 400 μL prob hibridizasyon tamponunda 5 dakika inkübe edin. Hafifçe pipetleyerek dokunun tampona tamamen daldırıldığından emin olun.
2. Bir dizi prob hibridizasyon tamponunu 30 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtarak bir sonraki adıma hazırlanın.
3. Tamponu çıkarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca 400 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponu ile ön hibridize edin.
4. 8 pM prob ekleyerek hedef kemosensör reseptörleri (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a veya Orco) için prob çözeltisi yapın. 500 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponuna 8 μL 1 μM prob stoğu ekleyin.
5. Önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponunu çıkarın ve 400 μL ısıtılmış prob çözeltisi ile değiştirin.
6. Bir inkübatörün içine yerleştirilmiş ve bir kutunun altına örtülmüş bir nutatör üzerinde iki gece boyunca 37 ° C'de doku inkübe edin.

6. Prob amplifikasyonu

1. Prob yıkama tamponunu 37 ° C'ye ısıtın Dokuyu yıkama başına 5x, 10 dakika, 37 ° C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile durulayarak, inkübatörde nutlayarak fazla prob çözeltisini çıkarın.
   NOT: Adım 6.4 için hazırlık başlayabilir. Adım 6.4'teki nota bakın.
2. Numuneleri oda sıcaklığında %10 Tween-20 (SSCT) içeren 400 μL 5x salin-sodyum sitrat ile yıkama başına 2x, 5 dakika yıkayın. Amplifikasyon tamponunu bir tezgah üstünde oda sıcaklığına çözdürün.
3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 μL amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek dokuyu amplifikasyon için hazırlayın. Amplifikasyon tamponunun viskozitesi nedeniyle, dokular tamamen suya batırılmayabilir. Amplifikasyon tamponunu dokunun altına nazikçe pipetleyerek ve tamponu suya batırılana kadar dokunun üstüne atarak karıştırın.
4. 6 μL 3 μM stoğu 95 °C'de 90 saniye ısıtarak ve karanlık bir çekmecede 30 dakika oda sıcaklığına soğutarak 18 pM firkete h1 ve 18 pM firkete h2'yi ayrı ayrı hazırlayın. Bir termal döngüleyicide ısıtırken saç tokalarının buharlaşmasını önlemek için PCR tüplerinin sıkıca kapatıldığından emin olun.
   NOT: Zaman kazanmak için, adım 6.1'deki 4^{. yıkama} adımında adım 6.4 başlatılabilir. Çapraz reaksiyonu önlemek için saç tokaları ayrı ayrı ısıtılmalıdır. Saç tokaları bu adımda herhangi bir tampon ile seyreltilmemelidir. Saç tokaları, problarla birlikte prob üreticisinden satın alınabilir.
5. Adım 6.3'te eklenen amplifikasyon tamponunu, 100 μL amplifikasyon tamponu ile birlikte ısıtılmış saç tokalarını (adım 6.4'ten itibaren) içeren bir karışımla değiştirin. Tipik bir reaksiyon 6 μL h1, 6 μL h2 ve 100 μL amplifikasyon tamponu içerecektir.
   NOT: Saç tokaları h1 ve h2, oda sıcaklığına soğutulduktan sonra birleştirilebilir ve daha sonra 100 μL amplifikasyon tamponuna eklenebilir. Doku örneklerinin bir tüpten diğerine aktarılmasını önlemek için, adım 6.3'teki amplifikasyon tamponu çıkarılabilir ve amplifikasyon tamponunda seyreltilmiş saç tokası karışımı ile değiştirilebilir.
6. Dokuyu gece boyunca inkübe edin ve nutatörün varsayılan hızını kullanarak oda sıcaklığında karanlıkta nutat edin.

7. Montaj dokusu örneği

1. İnkübe edilmiş dokudaki amplifikasyon tamponunu 300 μL 5x SSCT (Tween-20'de seyreltilmiş sodyum klorür-sodyum sitrat) ile seyreltin.
   NOT: Seyreltme, viskoziteyi azaltmaya yardımcı olur ve amplifikasyon tamponunun dokudan çıkarılmasını kolaylaştırır. Hücre zarını geçirgen hale getirmek için ajanlar olarak eylemlerindeki farklılıklar nedeniyle ön fiksatif için Triton-X 100 ve fiksasyon sonrası adım için Tween-20 kullandık.
2. Dokuyu oda sıcaklığında 400 μL 5x SSCT ile 5x yıkayın.
   NOT: Gerekirse, mendili takılmaya hazır olana kadar geçici olarak 4 °C'de saklayın. Görüntülemeden önce 2 günü geçmedik.
3. Bir cam slayt üzerine 5 damla montaj çözeltisi yapın. 200 μL'lik bir pipet ucunun ucunu daha geniş hale getirmek için kesin ve dokuyu yeni bir cam slayta aktarın.
4. Doku örneklerini forseps ile tabanlarından tutun ve bir dizi montaj solüsyonu damlacığına hafifçe daldırın ve durulayın. Bu adımda dokuları kırmamaya dikkat edin.
5. Montaj solüsyonu ile monte edin, lamel yerleştirin ve oje ile kapatın. Konfokal mikroskop kullanarak in situ doku örneklerini görüntüleyin.

Sonuçlar

Anopheles anteninde kemosensör genlerin sağlam tespiti
Sivrisinek koku dokularında kemosensör reseptörlerinin ekspresyonunu saptamak için HCR FISH yönteminin (Şekil 1) duyarlılığını araştırdık. Dişi Anofel sivrisinek anteninde daha önce bildirilen RNA transkript verilerinin rehberliğinde, çeşitli IR'leri hedeflemek için problar ürettik. Dört bağımsız anten transkriptom çalışmasından elde edilen ortalama transkript değerler...

Tartışmalar

Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR), birkaç RNA hedefini görselleştirme konusundaki duyarlılığı ve sağlamlığı ile dikkat çekicidir⁸. HCR WM-FISH, Drosophila, tavuk, fare ve zebra balığı embriyolarının yanı sıra nematod ve zebra balığı^{larvalarında başarıyla kullanılmıştır 10,16,17}. Sivrisinek antenleri ve maksiller palplar tipik olarak yüksek otoflo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M	Sigma-Aldrich	21115-100ML
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-50UN
Chymotrypsin	Sigma-Aldrich	CHY5S-10VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf tube	VWR	20901-551	1.5 mL
Forceps	Dumont	11251	Number 5
Gel loading tip	Costar	4853	1-200 µL tip
Hairpins	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M)	Sigma-Aldrich	H0887
IR25a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK149	AGAP010272
IR41t.1 probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK978	AGAP004432
IR64a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK700	AGAP004923
IR75d probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK976	AGAP004969
IR76b probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRI998	AGAP011968
IR7t probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRL355	AGAP002763
IR8a probe	Molecular Instruments	Probe Set ID: PRK150	AGAP010411
LoBind Tubes	VWR	80077-236	0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M	Thermo Fisher	AM9530G
Methanol	Fisher	A412-500
Nuclease-free water	Thermo Fisher	43-879-36
Nutator	Denville Scientific	Model 135	3-D Mini rocker
Orco probe	Molecular Instruments	Probe set ID PRD954	AGAP002560
Paraformaldehyde (20% )	Electron Microscopy Services	15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)	Thermo Fisher	AM9625
Probe hybridization buffer	Molecular Instruments	https://www.molecularinstruments.com/	50 mL
Probe wash buffer	Molecular Instruments	Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence	100 mL
Proteinase-K	Thermo Fisher	AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x	Thermo Fisher	15-557-044
SlowFade Diamond	Thermo Fisher	S36972	mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M	Invitrogen	AM9760G
Triton X-100  (10%)	Sigma-Aldrich	93443
Tween-20 (10% )	Teknova	T0027
Watch glass	Carolina	742300	1 5/8" square; transparent