JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة للمسح البصري السريع والمتزامن ، ووضع العلامات المستديرة المعطية ، وإعادة البناء الحجمي ثلاثي الأبعاد لعشرات أقسام الدماغ البشري بعد الوفاة من خلال الجمع بين تقنية تحويل الأنسجة القصيرة (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) مع التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني.

Abstract

على الرغم من العديد من تقنيات التطهير التي ظهرت في العقد الماضي ، لا تزال معالجة أدمغة البشر بعد الوفاة مهمة صعبة بسبب أبعادها وتعقيدها ، مما يجعل التصوير بدقة ميكرومتر صعبا بشكل خاص. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإجراء إعادة بناء الأجزاء الحجمية من الدماغ البشري عن طريق معالجة عشرات الأقسام في وقت واحد باستخدام بروتوكول تحويل الأنسجة SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) ، والذي يتيح التطهير ووضع العلامات والتصوير المتسلسل للعينات باستخدام المجهر الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). يوفر SHORT إزالة الأنسجة بسرعة ووضع علامات متعددة متجانسة للشرائح السميكة مع العديد من العلامات العصبية ، مما يتيح تحديد مجموعات فرعية عصبية مختلفة في كل من المادة البيضاء والرمادية. بعد المقاصة ، يتم تصوير الشرائح عبر LSFM بدقة ميكرومتر وفي قنوات متعددة في وقت واحد لإعادة بناء 3D سريعة. من خلال الجمع بين تحليل SHORT و LSFM ضمن بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على إعادة بناء العمارة الخلوية 3D للمناطق الحجمية الكبيرة بدقة عالية في وقت قصير ، وبالتالي تمكين التوصيف الهيكلي الشامل للدماغ البشري.

Introduction

يتطلب تحليل التنظيم الجزيئي 3D والهندسة الخلوية لكميات كبيرة من الدماغ البشري شفافية بصرية للعينات ، يتم تحقيقها من خلال بروتوكولات ذات وقت معالجة مكثف. تم تطوير تقنيات المسح البصري لتقليل عدم التجانس في معامل الانكسار (RI) داخل الأنسجة ، وبالتالي تقليل تشتت الضوء وزيادة عمق اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة1،2،3،4،5. تسمح التطورات الحالية في طرق التطهير ووضع العلامات على الأنسجة العميقة بالتصوير الحجمي لأعضاء القوارض والأجنة السليمة من خلال استغلال تقنيات الفحص المجهري المتطورة6،7،8،9،10،11،12.

ومع ذلك ، لا تزال إعادة البناء الحجمي 3D لمناطق واسعة من الدماغ البشري بعد الوفاة تمثل مهمة صعبة مقارنة بالكائنات الحية النموذجية. يمكن أن يؤدي التركيب البيولوجي المعقد وظروف التثبيت والتخزين المتغيرة بعد الوفاة إلى الإضرار بكفاءة إزالة الأنسجة وعمق اختراق الأجسام المضادة والتعرف على الحواتم13،14،15،16،17،18،19. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة الميكانيكية والتطهير ووضع العلامات اللاحقة لكل شريحة لتحقيق تطهير فعال ووضع علامات موحدة على مناطق الدماغ البشري الكبيرة ، مما يؤدي إلى أوقات معالجة طويلة والحاجة إلى معدات مخصصة متطورة ، مقارنة بالكائنات النموذجية15،20،21،22.

تم تطوير تقنية تحويل الأنسجة SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) خصيصا لتحليل كميات كبيرة من الدماغ البشري18,23. تستخدم هذه الطريقة الحفاظ على بنية الأنسجة لبروتوكول SWITCH11 وتركيزات عالية من هيدروجين البيروكسيد لتقليل التألق الذاتي للأنسجة ، بالاقتران مع ترميم الحاتمة. يسمح SHORT بتلطيخ موحد لشرائح الدماغ البشري مع علامات لأنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والأوعية الدموية والألياف الميالينية18,24. نتائجه متوافقة مع تحليل كل من البروتينات منخفضة وعالية الكثافة. تتيح مستويات الشفافية العالية الناتجة ووضع العلامات الموحدة إعادة البناء الحجمي للشرائح السميكة باستخدام المجهر الفلوري ، على وجه الخصوص ، من أجل الحصول السريع على جهاز الصفيحة الخفيفة الذي يمكن استخدامه18،24،25،26،27.

في هذا العمل ، نصف كيف يمكن استخدام تقنية تحويل الأنسجة القصيرة للتطهير المتزامن ووضع العلامات متعددة الجولات لعشرات أقسام الدماغ البشري الثابتة بالفورمالين. يمكن استخدام أربع علامات فلورية مختلفة معا ، مما يؤدي إلى تحديد مجموعات فرعية خلوية مختلفة. بعد التطهير ، يمكن إجراء التصوير الحجمي عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. هنا ، استخدمنا LSFM المقلوب حسب الطلب18،24،25،26،27 ، والذي يتيح التقسيم البصري السريع للعينة والاستحواذ السريع على قنوات متعددة بالتوازي. مع هذا البروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على توصيف خلوي وهيدي شامل مع دقة خلوية فرعية لمناطق واسعة من الدماغ البشري كما هو موضح بالفعل في رسم خرائط منطقة بروكابأكملها 23.

Protocol

تم توفير عينات الأنسجة البشرية الثابتة بالفورمالين من قبل قسم علم الأمراض العصبية في خدمة تشريح الجثة بمستشفى ماساتشوستس العام (MGH) (بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من المشاركين الأصحاء قبل الوفاة ، وفقا لبروتوكولات جمع الأنسجة المعتمدة من IRB من لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية للشركاء (PIBC ، البروتوكول 2003P001937). يتم الاحتفاظ بوثائق التفويض مع خدمات تشريح الجثة MGH في بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة ، وهي متاحة عند الطلب.

1. تضمين الأغاروز وقطع العينات

  1. قم بإعداد محلول أغاروز 4٪ w / v في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ، درجة الحموضة 7.4) في دورق وقم بتضمين كتلة الأنسجة بالداخل. انتظر حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ثم قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. للحصول على أقسام عالية الدقة ، قم بلصق العينة على قرص عينة الاهتزاز واملأ الدرج ب 1x PBS بارد (درجة الحموضة 7.4). اضبط معلمات الاهتزاز مثل التردد والسعة والسرعة وفقا لنوع الأنسجة المراد تقطيعها (القيم المستخدمة: التردد = 5 (50 هرتز) ؛ السعة = 0.4 ؛ السرعة = 3 (0.15 مم / ثانية).
    ملاحظة: يجب استخدام اهتزازات مختلفة اعتمادا على حجم العينة. بالنسبة للعينات التي يبلغ حجمها الأقصى 70 × 40 × 15 مم ، يمكن استخدام اهتزاز (على سبيل المثال ، Leica VT1000 S) ؛ بالنسبة للعينات الأكبر حجما ، من الممكن استخدام ضغط (على سبيل المثال ، VF-900-0Z Microtome18) أو جهاز مخصص21. هنا ، نقدم شرائح مقطوعة بسمك 400 ميكرومتر أو 500 ميكرومتر.
  3. بعد القطع ، ضع جميع الشرائح في محلول حافظة يتكون من 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) مع 0.01٪ وزن / v أزيد الصوديوم (NaN3) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قبل التضمين ، انتظر حتى يصل محلول الأغاروز إلى 37 درجة مئوية. قد تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى تلف العينة. يوصى بعدم ترك العينات في PFA لأكثر من 48 ساعة لأن التثبيت المطول قد يتداخل مع إجراء وضع العلامات عن طريق إتلاف المستضدات وزيادة التألق الذاتي للأنسجة. لتخزين الأنسجة البشرية على المدى الطويل ، يتم استخدام PBS مع NaN3 لمنع التلوث الميكروبي. بسبب سمية NaN3 ، قم بإعداد محلول الحافظة تحت غطاء كيميائي.

2. تثبيت الأنسجة

ملاحظة: يتم إعداد جميع المحاليل المستخدمة في البروتوكول التالي بكميات كبيرة ، كافية لمعالجة جميع شرائح نفس كتلة الأنسجة وتقليل التباين التقني وتقليل الوقت اللازم للخطوات الفردية.

  1. قم بإعداد محلول إيقاف التشغيل باستخدام 50٪ v / v 1x PBS pH 3 ، 25٪ v / v 0.1 M حمض الهيدروكلوريك (HCl) ، 25٪ v / v 0.1 M فثالات هيدروجين البوتاسيوم (KHP) ، و 4٪ v / v glutaraldehyde طازج. ضع جميع العينات في أطباق ذات أغطية لولبية (70 × 23 مم) واحتضانها بمحلول Switch-off مع اهتزاز لطيف عند 4 °C لمدة 1 يوم ، وحمايتها من الضوء بورق الألمنيوم.
  2. قم بإعداد محلول التبديل باستخدام 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) و 1٪ v / v glutaraldehyde طازج. ضع جميع العينات في أطباق جديدة واحتضانها بمحلول Switch-on مع اهتزاز لطيف عند 4 °C لمدة 1 يوم ، وحمايتها من الضوء بورق الألمنيوم.
    ملاحظة: نظرا للسمية العالية وحساسية الضوء للجلوتارالدهيد ، يجب دائما تحضير كل من محاليل إيقاف التشغيل والتشغيل طازجة وحفظها تحت الغطاء الكيميائي على الجليد. املأ الطبق دائما ب 20 مل من كل محلول وختمه بالأغشية.

3. التعطيل والمقاصة

ملاحظة: يجب تعطيل الجلوتارالدهيد التفاعلي في العينات عن طريق الحضانة بمحلول تعطيل يتكون من 1x PBS pH 7.4 ، 4٪ w / v acetamide ، 4٪ w / v glycine ، pH 9.0. يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. لإزالة الدهون وجعل الأنسجة شفافة ، نستخدم محلول المقاصة الذي يتكون من 200 مللي متر كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 20 مللي متر كبريتيت الصوديوم (Na2SO3) ، و 20 mM حمض البوريك (H3BO3) ، درجة الحموضة 9.0. يجب تخزين المحلول في RT حيث يترسب SDS عند 4 درجات مئوية. سيتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في أنابيب مملوءة بالمحلول.

  1. انقل العينات من الأطباق إلى الأنابيب واغسلها لمدة 3 × 2 ساعة مع 1x PBS pH 7.4 في RT في اهتزاز لطيف.
    ملاحظة: بالنسبة للخطوة 3.1 ، من الضروري العمل تحت الغطاء الكيميائي بسبب سمية الجلوتارالدهيد. الأسيتاميد ، SDS ، وحمض البوريك هي أيضا كواشف سامة ، ويجب التعامل معها تحت غطاء كيميائي. املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول.
  2. احتضان العينات في محلول التعطيل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي طوال الليل (o / n).
  3. يغسل لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBS درجة الحموضة 7.4 في RT في هز لطيف.
  4. احتضان العينات في محلول التطهير عند 55 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-7 أيام. تغيير الحل كل يومين (الجدول 1).

4. وضع العلامات المناعية

ملاحظة: قبل خطوة وضع العلامات ، من الضروري إزالة SDS المتبقي ، وتقليل التألق الذاتي ، وكشف الحواتم بمحلول استرجاع مستضد يتكون من قاعدة Tris 10 mM ، و 1 mM EDTA ، و 0.05٪ v / v Tween 20 ، pH 9. تم تحسين الرقم الهيدروجيني للمحلول البالغ 9 لعملية استرجاع فعالة. تعمل قاعدة Tris كعامل تخزين مؤقت للحفاظ على بيئة درجة الحموضة المستقرة ؛ EDTA ، وهو عامل مخلب ، يعزز إمكانية الوصول إلى المستضد. يساعد المنظف غير الأيوني Tween 20 في تحسين نفاذية الأنسجة. يمكن تخزين هذا المحلول عند 4 درجات مئوية. من المهم ملاحظة أن بيروكسيد الهيدروجين جنبا إلى جنب مع خطوة استرجاع المستضد لها تأثير تآزري في تقليل إشارة التألق الذاتي ، عن طريق تحطيم و / أو تعديل الفلوروفورات الداخلية المسؤولة عن إشارة الخلفية غير المحددة (مثل ليبوفوسين).

  1. قم بإعداد 1x PBS مع 0.1٪ v / v Triton X-100 (PBST) ، وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، واغسل العينات 3 × 3 ساعات خلال النهار في رج لطيف عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اترك آخر غسلة o / n.
    ملاحظة: قم بتخزين محلول مخزون PBST عند 4 درجات مئوية. من الضروري إزالة SDS من الأنسجة لأنها يمكن أن تشكل رواسب غير قابلة للذوبان في درجات حرارة منخفضة قد تتداخل مع عمليات الاستحواذ اللاحقة.
  2. في اليوم التالي ، أضف 10 مل من 30٪ v / v بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) إلى كل عينة واتركها مع رج لطيف في RT لمدة 45 دقيقة.
  3. اغسل 3 × 10 دقائق مع 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) مع اهتزاز لطيف في RT.
  4. سخن محلول استرجاع المستضد عند 95 درجة مئوية في حمام مائي ؛ انقل العينات إلى المحلول الساخن واتركها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. اترك العينات لتبرد إلى RT لمدة 40 دقيقة في اهتزاز لطيف.
  6. اغسل 3 × 5 دقائق بالماء منزوع الأيونات في رج لطيف.
  7. موازنة العينات في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. قم بإعداد محلول أجسام مضادة جديد مصنوع من PBST مع 0.01٪ وزن / وزن NaN3 (انظر الملاحظة للخطوة 1.3) وأضف الأجسام المضادة الأولية. احتضان العينات بالمحلول في أطباق ذات أغطية لولبية عند 37 درجة مئوية لمدة n أيام (1-7) في حاضنة مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء (الجدول 2).
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على الحجم والسمك (الجدول 1 والجدول 2).
  9. بعد n أيام ، انقل العينات إلى أنابيب واغسلها 3 × 2 ساعة باستخدام PBST المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف في الحاضنة.
  10. أضف الأجسام المضادة الثانوية في PBST مع 0.01٪ وزن / وزن NaN3 واحتضان العينات في أطباق جديدة بأغطية لولبية عند 37 درجة مئوية لمدة n أيام (1-6) في حاضنة مع اهتزاز لطيف ومحمية من الضوء (الجدول 1 والجدول 2).
  11. بعد n أيام ، انقل العينات إلى أنابيب واغسلها 3 × 3 ساعات خلال اليوم باستخدام PBST المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لطيفة. اترك آخر غسلة o / n.
    ملاحظة: نظرا لأن Triton X-100 و Tween 20 لزجان ، فإن الماصة ببطء للسماح للطرف بالملء. املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول. استخدم 10 مل من محاليل الأجسام المضادة لكل عينة وأغلق الطبق بالبارافيلم لمنع تبخر المحلول. نظرا لأن محاليل الأجسام المضادة تحتوي على NaN3 ، فيمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها لتسمية عينات جديدة في غضون 2 أسابيع.

5. مطابقة معامل الانكسار

ملاحظة: لتحقيق مستوى عال من الشفافية ، من الضروري تجانس معامل انكسار الأنسجة. هنا نستخدم 2،2'-ثيوديثانول (TDE) مخفف في 1x PBS. يجب تخزين حلول TDE في RT.

  1. انقل العينات إلى أطباق جديدة ، وأضف 30٪ v / v TDE ، واتركها لمدة 4 ساعات مع اهتزاز لطيف في RT.
  2. قم بإزالة محلول 30٪ v / v TDE ، وأضف 68٪ v / v TDE إلى العينات ، واتركها مع اهتزاز لطيف في RT.
    ملاحظة: نظرا لأن TDE لزج ، فإن الماصة ببطء للسماح للطرف بالملء. استنشاق بخار TDE أو الضباب يمكن أن يهيج الجهاز التنفسي. لذلك ، ينصح بالعمل في منطقة جيدة التهوية أو استخدام أغطية الدخان لتقليل التعرض. يجب تخزين حلول TDE في RT. استخدم 10 مل من حلول TDE لكل عينة.

6. تركيب العينة

ملاحظة: لتسهيل تركيب العينة والحصول على صورة LSFM ، نستخدم حامل عينة مختوم ومصنوع خصيصا (يسمى "شطيرة") ، والذي يتكون من ثلاثة أجزاء: شريحة مجهر ، وفاصل ، وغطاء غطاء.

  1. ضع الفاصل الفولاذي (56 × 56 × 0.5 مم3) فوق شريحة المجهر (60 × 60 × 1 مم3) وضع العينة على شريحة الفحص المجهري.
  2. ضع غطاء الكوارتز بعناية (60 × 60 × 0.5 مم3) ، وقم بقص كل شيء معا ، وقم بإعداد غراء سيليكون مكون من عنصرين بنسبة 1: 1. استخدم غطاء كوارتز لمطابقة معامل الانكسار وتقليل الانحراف البصري أثناء عملية الاستحواذ.
  3. باستخدام حقنة سعة 1 مل ، املأ الفراغ بين الفاصل وغطاء الغطاء بغراء سيليكون مكون من عنصرين واتركه يجف لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة المشابك واستخدم إبرة صغيرة لملء الساندويتش بالكامل ببطء بنسبة 68٪ v / v TDE.
  5. اصنع غراء طازجا وختم الساندويتش.
    ملاحظة: إذا وصل TDE عن طريق الخطأ إلى الفاصل في الخطوة 6.1 ، فلن يعالج الغراء. تأكد من عدم تشكل فقاعات هواء أثناء الخطوة 6.2.

7. تجريد

ملاحظة: يسمح الحفظ الهيكلي وإمكانية الوصول المحسنة إلى SHORT بوضع علامات متعددة الجولات على الشرائح عن طريق إزالة الأجسام المضادة وإعادة تلطيخ العينات بعلامات أخرى.

  1. افتح الساندويتش بشفرة ، ضع العينات في أطباق جديدة بأغطية لولبية مملوءة بنسبة 30٪ v / v TDE ، واتركها لمدة 3 ساعات.
  2. انقل العينات إلى الأنابيب ، واغسلها لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) في RT مع اهتزاز لطيف ، واترك آخر غسلة o / n.
  3. ضع العينات في محلول التطهير في حمام مائي على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  4. يغسل لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBST (درجة الحموضة 7.4) عند 37 درجة مئوية في رج لطيف ويترك آخر غسلة o / n. الآن العينة جاهزة للتسمية مرة أخرى بدءا من الخطوة 4.8.
    ملاحظة: املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول. استخدم 10 مل من محلول TDE لكل عينة.

النتائج

يتيح البروتوكول الموصوف هنا المعالجة المتزامنة لشرائح متعددة ، يتراوح سمكها من 100 ميكرومتر إلى 500 ميكرومتر ، باستخدام طريقة SHORT. هذا النهج يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة الإجمالي للإجراء بأكمله. في هذا العمل ، نقدم وصفا شاملا لخط الأنابيب بأكمله (الشكل 1) لمعالجة أقسام سميكة...

Discussion

يتطلب التصوير عالي الدقة وإعادة بناء 3D لمناطق الدماغ البشري الكبيرة تقسيما ميكانيكيا للأنسجة يليه المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية لشرائح مفردة. يصف البروتوكول المقدم هنا كيف يمكن استخدام طريقة تحويل الأنسجة القصيرة للمعالجة السريعة والمتزامنة لأقسام سميكة متعددة من الدماغ البش...

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

نشكر بروس فيشل ، مستشفى ماساتشوستس العام ، مركز إيه إيه مارتينوس للتصوير الطبي الحيوي ، قسم الأشعة ، على توفير عينات الدماغ البشري التي تم تحليلها في هذه الدراسة. حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج إطار البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 654148 (Laserlab-Europe) ، من برنامج إطار عمل Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار بموجب اتفاقية المنحة المحددة رقم 785907 (مشروع الدماغ البشري SGA2) ورقم 945539 (مشروع الدماغ البشري SGA3) ، من مركز مؤسسة المستشفيات العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم U01 MH117023 ، ومن وزارة التعليم الإيطالية في إطار العقدة الإيطالية للتصوير الحيوي الأوروبي (البنية التحتية لأبحاث ESFRI). أخيرا ، تم إجراء هذا البحث بمساهمة "Fondazione CR Firenze". محتوى هذا العمل هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

References

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved