المقاصة البصرية ووضع العلامات للفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في تصوير الدماغ البشري على نطاق واسع

Summary

يوفر البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة للمسح البصري السريع والمتزامن ، ووضع العلامات المستديرة المعطية ، وإعادة البناء الحجمي ثلاثي الأبعاد لعشرات أقسام الدماغ البشري بعد الوفاة من خلال الجمع بين تقنية تحويل الأنسجة القصيرة (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) مع التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني.

Abstract

على الرغم من العديد من تقنيات التطهير التي ظهرت في العقد الماضي ، لا تزال معالجة أدمغة البشر بعد الوفاة مهمة صعبة بسبب أبعادها وتعقيدها ، مما يجعل التصوير بدقة ميكرومتر صعبا بشكل خاص. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإجراء إعادة بناء الأجزاء الحجمية من الدماغ البشري عن طريق معالجة عشرات الأقسام في وقت واحد باستخدام بروتوكول تحويل الأنسجة SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) ، والذي يتيح التطهير ووضع العلامات والتصوير المتسلسل للعينات باستخدام المجهر الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). يوفر SHORT إزالة الأنسجة بسرعة ووضع علامات متعددة متجانسة للشرائح السميكة مع العديد من العلامات العصبية ، مما يتيح تحديد مجموعات فرعية عصبية مختلفة في كل من المادة البيضاء والرمادية. بعد المقاصة ، يتم تصوير الشرائح عبر LSFM بدقة ميكرومتر وفي قنوات متعددة في وقت واحد لإعادة بناء 3D سريعة. من خلال الجمع بين تحليل SHORT و LSFM ضمن بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على إعادة بناء العمارة الخلوية 3D للمناطق الحجمية الكبيرة بدقة عالية في وقت قصير ، وبالتالي تمكين التوصيف الهيكلي الشامل للدماغ البشري.

Introduction

يتطلب تحليل التنظيم الجزيئي 3D والهندسة الخلوية لكميات كبيرة من الدماغ البشري شفافية بصرية للعينات ، يتم تحقيقها من خلال بروتوكولات ذات وقت معالجة مكثف. تم تطوير تقنيات المسح البصري لتقليل عدم التجانس في معامل الانكسار (RI) داخل الأنسجة ، وبالتالي تقليل تشتت الضوء وزيادة عمق اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة^{1،2،3،4،5}. تسمح التطورات الحالية في طرق التطهير ووضع العلامات على الأنسجة العميقة بالتصوير الحجمي لأعضاء القوارض والأجنة السليمة من خلال استغلال تقنيات الفحص المجهري المتطورة^6،....

Protocol

تم توفير عينات الأنسجة البشرية الثابتة بالفورمالين من قبل قسم علم الأمراض العصبية في خدمة تشريح الجثة بمستشفى ماساتشوستس العام (MGH) (بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من المشاركين الأصحاء قبل الوفاة ، وفقا لبروتوكولات جمع الأنسجة المعتمدة من IRB من لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية للشركاء (PIBC ، البروتوكول 2003P001937). يتم الاحتفاظ بوثائق التفويض مع خدمات تشريح الجثة MGH في بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة ، وهي متاحة عند الطلب.

1. تضمين الأغاروز وقطع العينات

1. قم بإعداد محلول أغاروز 4٪ w / v في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ، درجة الحموضة 7.4) في دورق وقم بتضمين كتلة الأنسجة....

النتائج

يتيح البروتوكول الموصوف هنا المعالجة المتزامنة لشرائح متعددة ، يتراوح سمكها من 100 ميكرومتر إلى 500 ميكرومتر ، باستخدام طريقة SHORT. هذا النهج يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة الإجمالي للإجراء بأكمله. في هذا العمل ، نقدم وصفا شاملا لخط الأنابيب بأكمله (الشكل 1) لمعالجة أقسام سميكة.......

Discussion

يتطلب التصوير عالي الدقة وإعادة بناء 3D لمناطق الدماغ البشري الكبيرة تقسيما ميكانيكيا للأنسجة يليه المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية لشرائح مفردة. يصف البروتوكول المقدم هنا كيف يمكن استخدام طريقة تحويل الأنسجة القصيرة للمعالجة السريعة والمتزامنة لأقسام سميكة متعددة من الدماغ البش.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200