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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

本方案通过将 （SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） SHORT 组织转化技术与常规高通量方案中的光片荧光显微镜成像相结合，为数十个死后人脑切片的快速和同时光学清除、多轮标记和 3D 体积重建提供了分步程序。

摘要

尽管在过去十年中出现了许多清除技术，但由于其尺寸和复杂性，处理死后人类大脑仍然是一项具有挑战性的任务，这使得微米分辨率的成像特别困难。本文提出了一种方案，通过使用 SHORT （SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） 组织转化方案同时处理数十个切片来执行人脑体积部分的重建，该协议能够使用光片荧光显微镜 （LSFM） 对样品进行透明、标记和顺序成像。SHORT提供快速的组织清除和具有多个神经元标记的厚切片的均质多标记，能够识别白质和灰质中的不同神经元亚群。清除后，通过LSFM以微米分辨率同时在多个通道中对切片进行成像，以进行快速的3D重建。通过在常规高通量方案中将SHORT与LSFM分析相结合，可以在短时间内以高分辨率获得大体积区域的3D细胞结构重建，从而实现人脑的全面结构表征。

引言

分析大量人脑的 3D 分子组织和细胞结构需要标本的光学透明度，这是通过具有大量处理时间的方案实现的。开发了光学清除技术以最大限度地减少组织内折射率 （RI） 的异质性，从而减少光散射并增加高分辨率成像的光穿透深度 1,2,3,4,5。目前清除和深层组织标记方法的进展允许通过利用尖端显微镜技术对完整的啮齿动物器官和胚胎进行体积成像 6,7,8,9,10,11,12。

然而，与模式生物相比，死后人脑大面积的体积3D重建仍然是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成和多变的死后固定和储存条件会影响组织清除....

研究方案

福尔马林固定的人体组织样本由马萨诸塞州总医院 （MGH） 尸检服务（美国波士顿）的神经病理学部门提供。根据合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，协议 2003P001937）批准的组织收集方案，在死亡前获得健康参与者的书面同意。授权文件保存在美国马萨诸塞州波士顿的 MGH 尸检服务处，并可根据要求提供。

1. 琼脂糖包埋和样品切割

  1. 在烧杯中制备 4% w/v 琼脂糖溶液，在 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，并将组织块嵌入其中。等到达到室温（RT），然后在4°C下储存24小时。
  2. 为了获得高精度切片，将样品粘在振动切片机的样品盘上，并用冷的 1x PBS （pH 7.4） 填充托盘。根据要切片的组织类型调整振动切片机参数，例如频率、振幅和速度（使用的值：频率 = 5 （50 Hz）、振幅 = 0.4、速度 = 3 （0.15 mm/s）。
    注意：应根据样品量使用不同的振动器。对于最大体积为 70 x 40 x 15 mm 的样品，可以使用振动切片机（例如徕卡 VT1000 S）;对于较大的样品，可以使用压缩机（例如，VF-900-0Z 切片机18）或定制设备21。在这里，我们展示了厚度为 400 μm 或 500 μm 的切片。
  3. 切割后，将所有切片放入由1x PBS（pH....

代表性结果

这里描述的方案允许使用SHORT方法同时处理多个切片，厚度范围从100μm到500μm。这种方法大大缩短了整个过程的整体处理时间。在这项工作中，我们提供了整个管道（图1）的全面描述，用于同时处理多个死后人脑厚切片，并一次演示了24个切片的协议（图2A）。考虑到样品的大小和厚度（表1），清除和共标记的持续时间从11天到30天不等，?.......

讨论

大面积人脑的高分辨率成像和 3D 重建需要机械组织切片，然后对单个切片进行光学透明化和免疫标记。这里介绍的协议描述了如何使用 SHORT 组织转化方法快速同时处理多个人脑厚切片，以便使用 LSFM 进行亚细胞分辨率的 3D 脑重建。

与其他方法不同，使用SHORT方法，清算和多重标签步骤不需要复杂的定制设备。可以完全处理大量标本，从而减少大型人脑组织块的处理时间，并.......

披露声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢马萨诸塞州总医院放射科 AA Martinos 生物医学成像中心的 Bruce Fischl 提供本研究中分析的人脑标本。该项目获得了欧盟地平线2020研究与创新框架计划（Laserlab-Europe）第654148号赠款协议的资助，欧盟地平线2020研究与创新框架计划根据第785907号（人脑项目SGA2）和第945539号（人脑项目SGA3）获得资助，来自美国国立卫生研究院综合医院公司中心，奖励编号为U01 MH117023， 以及意大利教育部在欧洲生物成像意大利节点（ESFRI研究基础设施）框架内。最后，这项研究是在“Fondazione CR Firenze”的贡献下进行的。本文内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

参考文献

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing.

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