光片荧光显微镜在大规模人脑成像中的光学透明化和标记

摘要

本方案通过将 （SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） SHORT 组织转化技术与常规高通量方案中的光片荧光显微镜成像相结合，为数十个死后人脑切片的快速和同时光学清除、多轮标记和 3D 体积重建提供了分步程序。

摘要

尽管在过去十年中出现了许多清除技术，但由于其尺寸和复杂性，处理死后人类大脑仍然是一项具有挑战性的任务，这使得微米分辨率的成像特别困难。本文提出了一种方案，通过使用 SHORT （SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） 组织转化方案同时处理数十个切片来执行人脑体积部分的重建，该协议能够使用光片荧光显微镜 （LSFM） 对样品进行透明、标记和顺序成像。SHORT提供快速的组织清除和具有多个神经元标记的厚切片的均质多标记，能够识别白质和灰质中的不同神经元亚群。清除后，通过LSFM以微米分辨率同时在多个通道中对切片进行成像，以进行快速的3D重建。通过在常规高通量方案中将SHORT与LSFM分析相结合，可以在短时间内以高分辨率获得大体积区域的3D细胞结构重建，从而实现人脑的全面结构表征。

引言

分析大量人脑的 3D 分子组织和细胞结构需要标本的光学透明度，这是通过具有大量处理时间的方案实现的。开发了光学清除技术以最大限度地减少组织内折射率 （RI） 的异质性，从而减少光散射并增加高分辨率成像的光穿透深度 1,2,3,4,5。目前清除和深层组织标记方法的进展允许通过利用尖端显微镜技术对完整的啮齿动物器官和胚胎进行体积成像 6,7,8,9,10,11,12。

然而，与模式生物相比，死后人脑大面积的体积3D重建仍然是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成和多变的死后固定和储存条件会影响组织清除效率、抗体渗透深度和表位识别^{13、14、15、16、17、18、19}。此外，与模式生物相比，仍然需要机械组织切片和随后的每个切片的清除和标记，以实现大面积人脑区域的高效清除和均匀标记，导致处理时间长，并且需要复杂的定制设备15,20,21,22。

SWITCH - H₂O₂ - antigen Retrieval -TDE （SHORT） 组织转化技术是专门为分析大量人脑而开发的^18,23。该方法采用SWITCH方案¹¹的组织结构保存和高浓度的过氧化氢来减少组织自发荧光，并结合表位恢复。SHORT 允许使用不同神经元亚型、神经胶质细胞、脉管系统和有髓纤维的标记物对人脑切片进行均匀染色^18,24。其结果与低密度和高密度蛋白质的分析兼容。由此产生的高透明度水平和均匀的标记使得用荧光显微镜对厚切片进行体积重建，特别是对于快速采集光片的设备，可以使用18,24,25,26,27。

在这项工作中，我们描述了如何使用 SHORT 组织转化技术同时清除和多轮标记数十个福尔马林固定的人脑切片。四种不同的荧光标记可以一起使用，从而鉴定不同的细胞亚群。清除后，可以使用荧光显微镜进行高分辨率体积成像。在这里，我们使用了定制的倒置 LSFM^{18、24、25、26、27}，它可以对样品进行快速光学切片并并行快速采集多个通道。通过这种常规的高通量方案，可以获得全面的细胞和结构表征，并具有人脑大面积的亚细胞分辨率，正如在整个布罗卡区域²³ 的映射中已经证明的那样。

研究方案

福尔马林固定的人体组织样本由马萨诸塞州总医院 （MGH） 尸检服务（美国波士顿）的神经病理学部门提供。根据合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，协议 2003P001937）批准的组织收集方案，在死亡前获得健康参与者的书面同意。授权文件保存在美国马萨诸塞州波士顿的 MGH 尸检服务处，并可根据要求提供。

1. 琼脂糖包埋和样品切割

1. 在烧杯中制备 4% w/v 琼脂糖溶液，在 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，并将组织块嵌入其中。等到达到室温（RT），然后在4°C下储存24小时。
2. 为了获得高精度切片，将样品粘在振动切片机的样品盘上，并用冷的 1x PBS （pH 7.4） 填充托盘。根据要切片的组织类型调整振动切片机参数，例如频率、振幅和速度（使用的值：频率 = 5 （50 Hz）、振幅 = 0.4、速度 = 3 （0.15 mm/s）。
   注意：应根据样品量使用不同的振动器。对于最大体积为 70 x 40 x 15 mm 的样品，可以使用振动切片机（例如徕卡 VT1000 S）;对于较大的样品，可以使用压缩机（例如，VF-900-0Z 切片机¹⁸）或定制设备²¹。在这里，我们展示了厚度为 400 μm 或 500 μm 的切片。
3. 切割后，将所有切片放入由1x PBS（pH 7.4）和0.01%w / v叠氮化钠（NaN₃）组成的保存溶液中，并储存在4°C。
   注意：包埋前，等到琼脂糖溶液达到37°C。 较高的温度可能会损坏试样。建议不要将样品留在 PFA 中超过 48 小时，因为长时间固定可能会破坏抗原和增加组织自发荧光，从而干扰标记过程。对于人体组织的长期储存，含有 NaN₃ 的 PBS 用于防止微生物污染。由于 NaN₃ 的毒性，在化学罩下制备防腐剂溶液。

2.组织固定

注意：以下方案中使用的所有溶液均以大体积制备，足以处理同一组织块的所有切片，并最大限度地减少技术差异并减少单个步骤的时间。

1. 用 50% v/v 1x PBS pH 3、25% v/v 0.1 M 盐酸 （HCl）、25% v/v 0.1 M 邻苯二甲酸氢钾 （KHP） 和新鲜的 4% v/v 戊二醛制备关闭溶液。将所有样品放入带螺旋盖（70 x 23 mm）的培养皿中，并用关闭溶液在4°C轻轻摇动孵育1天，用铝箔保护它们免受光照。
2. 用 1x PBS（pH 7.4）和新鲜的 1% v/v 戊二醛制备 Switch-on 溶液。将所有样品放入新培养皿中，并用Switch-on溶液孵育，在4°C下轻轻摇动1天，用铝箔保护它们免受光线照射。
   注意： 由于戊二醛的高毒性和光敏性，关闭和打开溶液都必须始终新鲜制备并保存在冰上的化学罩下。始终用每种溶液 20 mL 填充培养皿，并用封口膜密封。

3. 灭活和清除

注意：样品中的反应性戊二醛必须通过与由 1x PBS pH 7.4、4% w/v 乙酰胺、4% w/v 甘氨酸、pH 9.0 组成的灭活溶液孵育来灭活。该溶液可在4°C下储存长达3个月。为了去除脂质并使组织透明，我们使用由 200 mM 十二烷基硫酸钠 （SDS）、20 mM 亚硫酸钠 （Na₂SO₃） 和 20 mM 硼酸 （H₃BO₃） 组成的透明溶液，pH 值为 9.0。溶液必须储存在室温下，因为SDS在4°C下沉淀。 以下所有步骤都将在充满溶液的试管中完成。

1. 将样品从培养皿移至试管中，并在室温下用1x PBS pH 7.4轻轻摇动洗涤3×2小时。
   注意：对于步骤 3.1，由于戊二醛毒性，有必要在化学罩下工作。乙酰胺、SDS和硼酸也是有毒试剂，必须在化学罩下处理。始终用每种溶液 50 mL 填充试管。
2. 将样品在37°C的灭活溶液中在水浴中孵育过夜（o / n）。
3. 在室温下在1x PBS pH 7.4中轻轻摇动3 x 2小时。
4. 将样品在55°C的透明溶液中在水浴中孵育3-7天。每 2 天更换一次溶液（表 1）。

4. 免疫标记

注意：在标记步骤之前，有必要去除残留的 SDS，减少自发荧光，并用由 10 mM Tris 碱基、1 mM EDTA 和 0.05% v/v 吐温 20、pH 9 组成的抗原修复溶液揭开表位。该溶液的 pH 值为 9，经过优化，可实现高效的检索过程;Tris碱作为缓冲剂，以维持稳定的pH环境;EDTA是一种螯合剂，可增强抗原的可及性。非离子洗涤剂 Tween 20 有助于改善组织的通透性。该溶液可以储存在4°C。 需要注意的是，过氧化氢与抗原修复步骤相结合，通过分解和/或修饰负责非特异性背景信号的内源性荧光团（如脂褐素），在降低自发荧光信号方面具有协同作用。

1. 用0.1%v / v Triton X-100（PBST）制备1x PBS，将其预热至37°C，并在培养箱中在37°C下轻轻摇动中洗涤样品3×3小时。保持最后一次洗涤 o/n。
   注意：将PBST储备溶液储存在4°C。 从组织中去除SDS至关重要，因为它会在低温下形成不溶性沉淀物，这可能会干扰后续的采集过程。
2. 第二天，向每个样品中加入 10 mL 30% v/v 过氧化氢 （H₂O₂），并在室温下轻轻摇动 45 分钟。
3. 用 1x PBS（pH 7.4）洗涤 3 x 10 分钟，并在室温下轻轻摇动。
4. 在水浴中将抗原修复溶液预热至95°C;将样品转移到加热的溶液中，并在95°C下放置10分钟。
5. 让试样在轻轻摇晃中冷却至室温40分钟。
6. 用去离子水轻轻摇晃洗涤 3 x 5 分钟。
7. 在4°C下在PBS中平衡样品15分钟。
8. 用0.01%w / v NaN₃ 制备由PBST制成的新鲜抗体溶液（参见步骤1.3的注释）并加入一抗。将样品与溶液一起在带螺旋盖的培养皿中在37°C下孵育n天（1-7），在培养箱中轻轻摇晃并避光（表2）。
   注：孵育时间取决于大小和厚度（表 1 和表 2）。
9. n天后，将样品移入试管中，并在培养箱中用37°C预热的PBST洗涤3×2小时，轻轻摇动。
10. 在PBST中加入0.01%w / v NaN₃ 的二抗，并将样品在37°C的螺旋盖新培养皿中孵育n天（1-6），在培养箱中轻轻摇晃并避光（表1和表2）。
11. n天后，将样品转移到试管中，并在37°C下用预热的PBST在温和的摇动培养箱中洗涤3 x 3小时。保持最后一次洗涤 o/n。
    注意： 由于 Triton X-100 和 Tween 20 是粘性的，请缓慢移液以使吸头充满。始终用每种溶液 50 mL 填充试管。每个样品使用 10 mL 抗体溶液，并用封口膜密封培养皿以防止溶液蒸发。由于抗体溶液含有NaN_3， 因此它们可以储存在4°C下，并在2周内重复用于标记新标本。

5.折射率匹配

注意：为了达到高水平的透明度，有必要使组织折射率均匀化。在这里，我们使用在 1x PBS 中稀释的 2,2'-硫代二乙醇 （TDE）。TDE 溶液必须储存在室温下。

1. 将样品转移到新培养皿中，加入30%v / v TDE，并在室温下轻轻摇动4小时。
2. 取出 30% v/v TDE 溶液，向样品中加入 68% v/v TDE，并在室温下轻轻摇动。
   注意： 由于 TDE 是粘性的，请缓慢移液以使吸头充满。吸入TDE蒸气或雾气会刺激呼吸系统。因此，建议在通风良好的地方工作或使用通风橱以尽量减少暴露。TDE 溶液必须在室温下储存，每个样品使用 10 mL TDE 溶液。

6. 样品安装

注：为了便于样品安装和 LSFM 图像采集，我们使用定制的密封样品架（称为“三明治”），它由三部分组成：显微镜载玻片、垫片和盖玻片。

1. 将钢垫片（56×56×0.5mm3）放在显微镜载玻片（60×60×^1mm3）上，并将样品放在显微镜载玻片上。
2. 小心地放入石英盖玻片（60 x 60 x 0.5 mm³），将所有东西夹在一起，并以 1：1 的比例准备双组分硅胶。使用石英盖玻片来匹配折射率并减少采集过程中的光学像差。
3. 使用1mL注射器，用双组分硅胶填充垫片和盖玻片之间的空间，并使其干燥10分钟。
4. 取下夹子，用一根小针慢慢用 68% v/v TDE 填充整个三明治。
5. 制作新鲜的胶水并密封三明治。
   注意： 如果 TDE 在步骤 6.1 中意外到达垫片，则胶水将无法固化。确保在步骤 6.2 期间没有形成气泡。

7. 剥离

注：SHORT的结构保留和增强的表位可及性允许通过去除抗体并用其他标记物重新染色样品来对切片进行多轮标记。

1. 用刀片打开三明治，将标本放入装有30%v / v TDE的螺旋盖的新培养皿中，并放置3小时。
2. 将样品转移到试管中，在室温下在1x PBS（pH 7.4）中轻轻摇动洗涤3 x 2小时，并保留最后一次洗涤o/n。
3. 将样品置于80°C水浴中的透明溶液中4小时。
4. 在37°C下在1x PBST（pH 7.4）中轻轻摇晃洗涤3×2小时，并保留最后一次洗涤o/n。现在，从步骤4.8开始，样品已准备好再次标记。
   注意：始终用每种溶液 50 mL 填充试管。每个样品使用 10 mL TDE 溶液。

结果

这里描述的方案允许使用SHORT方法同时处理多个切片，厚度范围从100μm到500μm。这种方法大大缩短了整个过程的整体处理时间。在这项工作中，我们提供了整个管道（图1）的全面描述，用于同时处理多个死后人脑厚切片，并一次演示了24个切片的协议（图2A）。考虑到样品的大小和厚度（表1），清除和共标记的持续时间从11天到30天不等，?...

讨论

大面积人脑的高分辨率成像和 3D 重建需要机械组织切片，然后对单个切片进行光学透明化和免疫标记。这里介绍的协议描述了如何使用 SHORT 组织转化方法快速同时处理多个人脑厚切片，以便使用 LSFM 进行亚细胞分辨率的 3D 脑重建。

与其他方法不同，使用SHORT方法，清算和多重标签步骤不需要复杂的定制设备。可以完全处理大量标本，从而减少大型人脑组织块的处理时间，并...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200