Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH - _H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.

Zusammenfassung

Trotz der zahlreichen Clearing-Techniken, die im letzten Jahrzehnt entstanden sind, bleibt die Verarbeitung postmortaler menschlicher Gehirne aufgrund ihrer Dimensionen und Komplexität, die die Bildgebung mit Mikrometerauflösung besonders schwierig machen, eine herausfordernde Aufgabe. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, um die Rekonstruktion volumetrischer Abschnitte des menschlichen Gehirns durchzuführen, indem gleichzeitig Dutzende von Schnitten mit dem SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) Gewebetransformationsprotokoll verarbeitet werden, das die Klärung, Markierung und sequenzielle Bildgebungder Proben mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht. SHORT ermöglicht eine schnelle Gewebereinigung und homogene Mehrfachmarkierung dicker Schichten mit mehreren neuronalen Markern und ermöglicht so die Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz. Nach der Säuberung werden die Schichten über LSFM mit Mikrometerauflösung und in mehreren Kanälen gleichzeitig für eine schnelle 3D-Rekonstruktion abgebildet. Durch die Kombination von SHORT mit LSFM-Analyse innerhalb eines routinemäßigen Hochdurchsatzprotokolls ist es möglich, die 3D-Zytoarchitektur-Rekonstruktion großer volumetrischer Areale mit hoher Auflösung in kurzer Zeit zu erhalten und so eine umfassende strukturelle Charakterisierung des menschlichen Gehirns zu ermöglichen.

Einleitung

Die Analyse der molekularen 3D-Organisation und Zytoarchitektur großer Volumina des menschlichen Gehirns erfordert eine optische Transparenz der Proben, die durch Protokolle mit langer Verarbeitungszeit erreicht wird. Optische Clearing-Techniken wurden entwickelt, um die Heterogenität des Brechungsindex (RI) innerhalb des Gewebes zu minimieren, wodurch die Lichtstreuung reduziert und die Lichteindringtiefe für hochauflösende Bildgebung erhöht^wird 1,2,3,4,5. Derzeitige Fortschritte bei der Klärung und der Markierung von tiefem Gewebe ermöglichen die volumetrische Bildgebung intakter Nagetierorgane und -embryonen unter Nutzung modernster Mikroskopietechniken 6,7,8,9,10,11,12.

Die volumetrische 3D-Rekonstruktion großer Bereiche des postmortalen menschlichen Gehirns stellt im Vergleich zu Modellorganismen jedoch noch eine herausfordernde Aufgabe dar. Die komplexe biologische Zusammensetzung und die variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen können die Effizienz der Gewebereinigung, die Eindringtiefe der Antikörper und die Epitoperkennung beeinträchtigen 13,14,15,16,17,18,19. Darüber hinaus ist immer noch ein mechanischer Gewebeschnitt und die anschließende Klärung und Markierung jeder einzelnen Scheibe erforderlich, um eine effiziente Klärung und gleichmäßige Markierung großer menschlicher Gehirnareale zu erreichen, was im Vergleich zu Modellorganismen zu langen Bearbeitungszeiten und dem Bedarf an ausgeklügelten kundenspezifischen Geräten führt 15,20,21,22.

Die S WITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval -TDE (SHORT) Gewebetransformationstechnik wurde speziell für die Analyse großer Volumina des menschlichen Gehirns entwickelt^18,23. Diese Methode nutzt die Gewebestrukturkonservierung des SWITCH-Protokolls¹¹ und hohe Konzentrationen von Peroxidwasserstoff, um die Autofluoreszenz des Gewebes in Kombination mit der Epitopwiederherstellung zu verringern. SHORT ermöglicht eine gleichmäßige Färbung menschlicher Hirnschnitte mit Markern für verschiedene neuronale Subtypen, Gliazellen, Gefäße und myelinisierte Fasern^18,24. Die Ergebnisse sind mit der Analyse von Proteinen mit niedriger und hoher Dichte kompatibel. Die daraus resultierende hohe Transparenz und gleichmäßige Markierung ermöglichen die volumetrische Rekonstruktion dicker Schichten mit Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für die schnelle Erfassung können Lichtblattapparaturen verwendet werden 18,24,25,26,27.

In dieser Arbeit beschreiben wir, wie die SHORT-Gewebetransformationstechnik für die gleichzeitige Klärung und mehrstufige Markierung von Dutzenden von formalinfixierten menschlichen Hirnschnitten verwendet werden kann. Vier verschiedene fluoreszierende Marker können zusammen verwendet werden, was zur Identifizierung verschiedener zellulärer Subpopulationen führt. Nach der Klärung kann eine hochauflösende volumetrische Bildgebung mit Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Hier haben wir ein speziell angefertigtes invertiertes LSFM 18,24,25,26,27 verwendet, das ein schnelles optisches Schneiden der Probe und eine schnelle parallele Erfassung mehrerer Kanäle ermöglicht. Mit diesem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll ist es möglich, eine umfassende zelluläre und strukturelle Charakterisierung mit einer subzellulären Auflösung großer Bereiche des menschlichen Gehirns zu erhalten, wie bereits in der Kartierung eines gesamten Broca-Areals^{gezeigt wurde 23}.

Protokoll

Formalinfixierte menschliche Gewebeproben wurden von der Abteilung für Neuropathologie des Autopsiedienstes des Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, USA) zur Verfügung gestellt. Die schriftliche Zustimmung der gesunden Teilnehmer wurde vor dem Tod gemäß den vom IRB genehmigten Gewebeentnahmeprotokollen des Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, Protokoll 2003P001937) eingeholt. Die Genehmigungsdokumente werden bei den MGH Autopsy Services in Boston, MA, USA, aufbewahrt und sind auf Anfrage erhältlich.

1. Agarose-Einbettung und Probenschneiden

1. Bereiten Sie eine 4%ige w/v-Agaroselösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einem Becherglas vor und betten Sie den Gewebeblock darin ein. Warten Sie, bis es Raumtemperatur (RT) erreicht hat, und lagern Sie es dann 24 Stunden lang bei 4 °C.
2. Um hochpräzise Schnitte zu erhalten, kleben Sie die Probe auf die Probenscheibe des Vibratoms und füllen Sie die Schale mit kaltem 1x PBS (pH 7,4). Passen Sie die Vibratomparameter wie Frequenz, Amplitude und Geschwindigkeit entsprechend der Art des zu schneidenden Gewebes an (verwendete Werte: Frequenz = 5 (50 Hz); Amplitude = 0,4; Geschwindigkeit = 3 (0,15 mm/s).
   HINWEIS: Je nach Probenvolumen sollten unterschiedliche Vibratome verwendet werden. Für Proben mit einem maximalen Volumen von 70 x 40 x 15 mm kann ein Vibratom (z.B. Leica VT1000 S) verwendet werden; Für größere Proben ist es möglich, ein Kompresstom (z. B. VF-900-0Z-Mikrotom¹⁸) oder eine speziell angefertigte Vorrichtung²¹ zu verwenden. Hier präsentieren wir Scheiben, die entweder mit einer Dicke von 400 μm oder 500 μm geschnitten wurden.
3. Nach dem Schneiden alle Scheiben in eine Konservierungslösung aus 1x PBS (pH 7,4) mit 0,01 Gew.-% Natriumazid (NaN₃) geben und bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Warten Sie vor dem Einbetten, bis die Agaroselösung 37 °C erreicht hat. Eine höhere Temperatur kann die Probe beschädigen. Es wird empfohlen, die Proben nicht länger als 48 Stunden in PFA zu belassen, da eine längere Fixierung das Markierungsverfahren beeinträchtigen kann, indem sie Antigene schädigt und die Autofluoreszenz des Gewebes erhöht. Für die Langzeitlagerung von menschlichem Gewebe wird PBS mit NaN₃ verwendet, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Aufgrund der Toxizität von NaN₃ ist die Konservierungslösung unter einer chemischen Haube herzustellen.

2. Fixierung des Gewebes

HINWEIS: Alle im folgenden Protokoll verwendeten Lösungen werden in großen Mengen hergestellt, die ausreichen, um alle Schichten desselben Gewebeblocks zu verarbeiten und die technische Variabilität zu minimieren und die Zeit für einzelne Schritte zu verkürzen.

1. Bereiten Sie die Abschaltlösung mit 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M Salzsäure (HCl), 25 % v/v 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat (KHP) und frischem 4 % v/v Glutaraldehyd vor. Geben Sie alle Proben in Schalen mit Schraubdeckel (70 x 23 mm) und inkubieren Sie sie mit der Switch-off-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
2. Bereiten Sie die Einschaltlösung mit 1x PBS (pH 7,4) und frischem 1% v/v Glutaraldehyd zu. Geben Sie alle Proben in neue Schalen und inkubieren Sie sie mit der Switch-on-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
   HINWEIS: Aufgrund der hohen Toxizität und Lichtempfindlichkeit von Glutaraldehyd müssen sowohl Abschalt- als auch Einschaltlösungen immer frisch zubereitet und unter der chemischen Haube auf Eis aufbewahrt werden. Füllen Sie die Schale immer mit 20 ml jeder Lösung und verschließen Sie sie mit Parafilm.

3. Inaktivierung und Clearing

HINWEIS: Reaktives Glutaraldehyd in den Proben muss durch Inkubation mit einer Inaktivierungslösung inaktiviert werden, die aus 1x PBS pH 7,4, 4 % w/v Acetamid, 4 % w/v Glycin, pH 9,0 besteht. Die Lösung kann bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Um Lipide zu entfernen und das Gewebe transparent zu machen, verwenden wir die Clearing-Lösung, bestehend aus 200 mM Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM Natriumsulfit (_Na2SO3) und 20 mM Borsäure (_H3BO3), pH 9,0. Die Lösung muss bei RT gelagert werden, da SDS bei 4 °C ausfällt. Alle folgenden Schritte werden in Röhrchen durchgeführt, die mit der Lösung gefüllt sind.

1. Die Proben aus dem Geschirr in die Röhrchen geben und 3 x 2 h mit 1x PBS pH 7,4 bei RT in leichtem Schütteln waschen.
   HINWEIS: Für Schritt 3.1 ist es notwendig, aufgrund der Glutaraldehyd-Toxizität unter der chemischen Haube zu arbeiten. Paracetamid, SDS und Borsäure sind ebenfalls toxische Reagenzien und müssen unter einer chemischen Haube gehandhabt werden. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung.
2. Die Proben werden in einer Inaktivierungslösung bei 37 °C in einem Wasserbad über Nacht (o/n) inkubiert.
3. 3 x 2 h in 1x PBS pH 7,4 bei RT unter leichtem Schütteln waschen.
4. Die Proben werden in einer Reinigungslösung bei 55 °C im Wasserbad für 3-7 Tage inkubiert. Wechseln Sie die Lösung alle 2 Tage (Tabelle 1).

4. Immunmarkierung

HINWEIS: Vor dem Markierungsschritt ist es notwendig, das restliche Sicherheitsdatenblatt zu entfernen, die Autofluoreszenz zu reduzieren und die Epitope mit einer Antigen-Rückgewinnungslösung zu demaskieren, die aus 10 mM Trisbase, 1 mM EDTA und 0,05 % v/v Tween 20, pH 9 besteht. Der pH-Wert der Lösung von 9 ist für einen effizienten Rückgewinnungsprozess optimiert. Trisbase wirkt als Puffermittel, um eine stabile pH-Umgebung aufrechtzuerhalten; EDTA, ein Chelatbildner, verbessert die Zugänglichkeit des Antigens. Das nichtionische Waschmittel Tween 20 trägt dazu bei, die Durchlässigkeit des Gewebes zu verbessern. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Wasserstoffperoxid in Kombination mit dem Antigen-Retrieval-Schritt einen synergistischen Effekt bei der Reduzierung des Autofluoreszenzsignals hat, indem die endogenen Fluorophore, die für das unspezifische Hintergrundsignal verantwortlich sind (wie Lipofuscin), abgebaut und/oder modifiziert werden.

1. 1x PBS mit 0,1% v/v Triton X-100 (PBST) vorbereiten, auf 37 °C vorwärmen und die Proben 3 x 3 h tagsüber bei leichtem Schütteln bei 37 °C im Inkubator waschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n.
   HINWEIS: Lagern Sie die PBST-Stammlösung bei 4 °C. Es ist von entscheidender Bedeutung, SDS aus dem Gewebe zu entfernen, da es bei niedrigen Temperaturen unlösliche Ausscheidungen bilden kann, die nachfolgende Aufnahmeprozesse beeinträchtigen können.
2. Am nächsten Tag werden 10 ml 30 % v/v Wasserstoffperoxid (_H2O2) zu jeder Probe gegeben und 45 Minuten lang bei RT leicht geschüttelt.
3. 3 x 10 min mit 1x PBS (pH 7,4) unter leichtem Schütteln bei RT waschen.
4. Die Antigen-Rückgewinnungslösung wird auf 95 °C im Wasserbad vorgewärmt; Die Proben werden in die erhitzte Lösung überführt und 10 min bei 95 °C belassen.
5. Lassen Sie die Proben 40 Minuten lang unter leichtem Schütteln auf RT abkühlen.
6. 3 x 5 min mit deionisiertem Wasser unter leichtem Schütteln waschen.
7. Die Proben werden in PBS bei 4 °C für 15 min ausgeglichen.
8. Frische Antikörperlösung aus PBST mit 0,01 Gew.-%_NaN3 herstellen (siehe HINWEIS zu Schritt 1.3) und Primärantikörper hinzufügen. Die Proben werden mit der Lösung in Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-7) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und Lichtschutz inkubiert (Tabelle 2).
   HINWEIS: Die Inkubationszeit ist größen- und dickenabhängig (Tabelle 1 und Tabelle 2).
9. Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und 3 x 2 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C unter leichtem Schütteln im Inkubator gewaschen.
10. Sekundärantikörper in PBST mit 0,01 Gew.-%_NaN3 zugeben und die Proben in neuen Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-6) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubieren (Tabelle 1 und Tabelle 2).
11. Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und tagsüber 3 x 3 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C in einem schonenden Schüttelinkubator gewaschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n.
    HINWEIS: Da Triton X-100 und Tween 20 viskos sind, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml Antikörperlösungen für jede Probe und versiegeln Sie die Schale mit Parafilm, um eine Verdunstung der Lösung zu verhindern. Da die Antikörperlösungen NaN_{3 enthalten,} können sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen zur Markierung neuer Proben wiederverwendet werden.

5. Anpassung des Brechungsindex

HINWEIS: Um ein hohes Maß an Transparenz zu erreichen, ist es notwendig, den Brechungsindex des Gewebes zu homogenisieren. Hier verwenden wir 2,2'-Thiodiethanol (TDE) verdünnt in 1x PBS. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden.

1. Übertragen Sie die Proben in neue Schalen, fügen Sie 30 % v/v TDE hinzu und lassen Sie sie 4 h lang bei leichtem Schütteln bei RT stehen.
2. Entfernen Sie die 30%ige v/v-TDE-Lösung, geben Sie 68 %ige v/v-TDE-Werte zu den Proben und lassen Sie sie bei RT leicht schütteln.
   HINWEIS: Da TDE viskos ist, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Das Einatmen von TDE-Dampf oder -Nebel kann die Atemwege reizen. Daher ist es ratsam, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten oder Abzüge zu verwenden, um die Exposition zu minimieren. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösungen für jede Probe.

6. Probenmontage

HINWEIS: Um die Probenmontage und die LSFM-Bildaufnahme zu erleichtern, verwenden wir einen speziell angefertigten, versiegelten Probenhalter (als "Sandwich" bezeichnet), der aus drei Teilen besteht: einem Objektträger, einem Abstandshalter und einem Deckglas.

1. Legen Sie den Stahlabstandshalter (56 x 56 x 0,5 mm³) über den Objektträger (60 x 60 x 1 mm³) und legen Sie die Probe auf den Objektträger.
2. Legen Sie das Quarzdeckglas (60 x 60 x 0,5 mm³) vorsichtig auf, klippen Sie alles zusammen und bereiten Sie einen Zweikomponenten-Silikonkleber im Verhältnis 1:1 vor. Verwenden Sie ein Quarzdeckglas, um den Brechungsindex anzupassen und die optische Aberration während des Aufnahmeprozesses zu reduzieren.
3. Füllen Sie mit einer 1-ml-Spritze den Raum zwischen dem Abstandshalter und dem Deckglas mit einem Zweikomponenten-Silikonkleber und lassen Sie ihn 10 Minuten trocknen.
4. Entferne die Clips und fülle mit einer kleinen Nadel langsam das gesamte Sandwich mit 68% v/v TDE.
5. Stellen Sie frischen Kleber her und verschließen Sie das Sandwich.
   HINWEIS: Wenn das TDE in Schritt 6.1 versehentlich den Abstandshalter erreicht, härtet der Kleber nicht aus. Stellen Sie sicher, dass sich in Schritt 6.2 keine Luftblasen bilden.

7. Abisolieren

HINWEIS: Die strukturelle Konservierung und die verbesserte Zugänglichkeit des Epitops von SHORT ermöglichen die Markierung von Schichten in mehreren Runden durch Entfernen der Antikörper und erneutes Färben der Proben mit anderen Markern.

1. Öffnen Sie das Sandwich mit einer Klinge, legen Sie die Proben in neue Schalen mit Schraubdeckeln, die mit 30 % v/v TDE gefüllt sind, und lassen Sie sie 3 Stunden lang stehen.
2. Die Proben werden in Röhrchen umgefüllt, 3 x 2 h in 1x PBS (pH 7,4) bei RT mit leichtem Schütteln gewaschen und die letzte Wäsche o/n gelassen.
3. Die Proben werden in einer Reinigungslösung in einem Wasserbad bei 80 °C für 4 h gegeben.
4. 3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) bei 37 °C unter leichtem Schütteln waschen und die letzte Wäsche o/n stehen lassen. Jetzt kann die Probe ab Schritt 4.8 erneut beschriftet werden.
   HINWEIS: Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösung für jede Probe.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Behandlung mehrerer Schichten mit einer Dicke von 100 μm bis 500 μm mit der SHORT-Methode. Dieser Ansatz reduziert die Gesamtbearbeitungszeit für das gesamte Verfahren erheblich. In dieser Arbeit bieten wir eine umfassende Beschreibung der gesamten Pipeline (Abbildung 1) für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer postmortaler Dickschnitte des menschlichen Gehirns und demonstrieren das Protokoll an 24 Schichten gleichzeitig (<...

Diskussion

Hochauflösende Bildgebung und 3D-Rekonstruktion großer menschlicher Hirnareale erfordern mechanische Gewebeschnitte, gefolgt von optischer Klärung und Immunmarkierung einzelner Schichten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die SHORT-Gewebetransformationsmethode für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirndickschnitte für die 3D-Hirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung mit LSFM verwendet werden kann.

Im Gegensatz zu anderen Ansätzen sind ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200