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要約

現在のプロトコルは(Sの魔女- H2O2 -抗原 Retrieval - 2,2' -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。

要約

過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。

概要

ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。

しかし、死後の人間の脳の広い領域の体積3D再構成は、モデル生物と比較して依然として困難な課題です。複雑な生物学的組成とさまざまな死後の固定および保存条件は、組織の透明化効率、抗体の浸透深さ、およびエピトープ認識を損なう可能性があります13、14、15、16、17、18、19。さらに、モデル生物と比較して、大きなヒトの脳領域の効率的な透明化と均一な標識を達成するためには、機械的組織切片とそれに続く各スライスの透明化と標識が依然として必要であり、その結果、処理時間が長くなり、高度なカスタム機器が必要になります15,20,21,22。

SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化 - TDE (SHORT) 組織形質転換技術は、ヒトの脳の大量の分析に特化して開発された18,23。この方法では、SWITCHプロトコル11の組織構造保存と高濃度の過酸化水素を使用して、エピトープ修復と組み合わせて組織の自家蛍光を減少させます。SHORTは、異なるニューロンサブタイプ、グリア細胞、血管系、および有髄線維のマーカーを用いて、ヒトの脳スライスを均一に染色することを可能にします18,24。その結果は、低密度および高密度タンパク質の両方の分析に適合します。得られた高い透明性レベルと均一な標識により、蛍光顕微鏡法による厚切りの体積再構成が可能になり、特に、高速取得ライトシート装置18、24、25、26、27を使用することができる。

この研究では、SHORT組織形質転換技術を使用して、ホルマリン固定された数十のヒト脳切片の同時透明化とマルチラウンドラベリングを行う方法について説明します。4つの異なる蛍光マーカーを併用することで、異なる細胞亜集団を同定することができます。クリアリング後、蛍光顕微鏡で高分解能の体積イメージングを行うことができます。ここでは、カスタムメイドの逆LSFM 18,24,25,26,27を使用し、サンプルの高速光学セクショニングと複数のチャンネルの並列取得を可能にしました。この日常的にハイスループットプロトコルにより、ブローカの領域全体のマッピングですでに実証されているように、人間の脳の広い領域の細胞内分解能で包括的な細胞および構造特性評価を得ることができます23。

プロトコル

ホルマリン固定ヒト組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院(MGH)剖検サービス(米国ボストン)の神経病理学部門から提供されました。Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC、プロトコル2003P001937)からIRBが承認した組織収集プロトコルに従って、死亡前に健康な参加者から書面による同意が得られました。承認文書は、米国マサチューセッツ州ボストンのMGH剖検サービスに保管されており、リクエストに応じて入手できます。

1. アガロース包埋とサンプル切断

  1. ビーカー内の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中の4%w/vアガロース溶液を調製し、組織ブロックを内部に埋め込みます。室温(RT)に達するまで待ってから、4°Cで24時間保存します。
  2. 高精度の切片を得るには、サンプルをビブラトームの検体ディスクに接着し、トレイに冷たい1x PBS(pH 7.4)を充填します。スライスする組織の種類に応じて、周波数、振幅、速度などのビブラトームパラメータを調整します(使用される値:周波数 = 5 (50 Hz)、振幅 = 0.4、速度 = 3 (0.15 mm/s)。
    注:サンプル量に応じて異なるビブラトームを使用する必要があります。最大容量が70 x 40 x 15 mmのサンプルには、ビブラトーム(Leica VT1000 Sなど)を使用できます。より大きなサンプルには、圧縮トーム(VF-900-0Zミクロトーム18など)またはカスタムメイドの装置21を使用することが可能です。ここでは、400μmまたは500μmの厚さでカットされたスライスを紹介します。
  3. 切断後、すべてのスライスを0.01% w/vアジ化ナトリウム(NaN3)を含む1x PBS(pH 7.4)からなる保存液に入れ、4°Cで保存します。
    注:包埋する前に、アガロース溶液が37°Cに達するまで待ってください。 温度が高くなると、試験片が損傷する可能性があります。長時間の固定は、抗原を損傷し、組織の自家蛍光を増加させることにより、標識手順に支障をきたす可能性があるため、サンプルをPFAに48時間以上放置しないことをお勧めします。ヒト組織の長期保存には、微生物汚染を防ぐためにNaN3 を含むPBSが使用されます。NaN3は毒性があるため、薬品フードの下で予備液を調製してください。

2. 組織固定

注:以下のプロトコルで使用されるすべての溶液は、同じ組織ブロックのすべてのスライスを処理し、技術的なばらつきを最小限に抑え、個々のステップの時間を短縮するのに十分な量で調製されています。

  1. 50% v/v 1x PBS pH 3、25% v/v 0.1 M 塩酸(HCl)、25% v/v 0.1 M フタル酸水素カリウム(KHP)、および新鮮な 4% v/v グルタルアルデヒドでスイッチオフ溶液を調製します。すべてのサンプルをスクリュー蓋付きのディッシュ(70 x 23 mm)に入れ、スイッチオフ溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。
  2. 1x PBS(pH 7.4)と新鮮な1% v/vグルタルアルデヒドでスイッチオン溶液を調製します。すべてのサンプルを新しいディッシュに入れ、スイッチオン溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。
    注意: グルタルアルデヒドは毒性が高く、光に敏感であるため、スイッチオフ溶液とスイッチオン溶液の両方を常に新鮮に調製し、氷上の化学フードの下に保管する必要があります。常に皿に各溶液20 mLを入れ、パラフィルムで密封します。

3. 無効化と消込

注:サンプル中の反応性グルタルアルデヒドは、1x PBS pH 7.4、4% w/v アセトアミド、4% w/v グリシン、pH 9.0からなる不活化溶液とインキュベーションして不活化する必要があります。溶液は4°Cで最大3ヶ月間保存できます。脂質を除去して組織を透明にするために、200 mMのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20 mMの亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、および20 mMのホウ酸(H3BO3)、pH 9.0からなる透明化溶液を使用します。SDSは4°Cで沈殿するため、溶液は室温で保存する必要があります。 以下のすべてのステップは、溶液で満たされたチューブで行われます。

  1. サンプルを皿からチューブに移し、1x PBS pH 7.4、室温で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄します。
    注意: ステップ3.1では、グルタルアルデヒドの毒性があるため、化学フードの下で作業する必要があります。アセトアミド、SDS、ホウ酸も有毒な試薬であり、薬品フードの下で取り扱う必要があります。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。
  2. サンプルを不活化溶液中で37°Cのウォーターバス中で一晩インキュベートします(o/n)。
  3. 穏やかに振とうしながら、室温で1x PBS pH 7.4で3 x 2時間洗浄します。
  4. サンプルを55°Cの透明溶液中でウォーターバス中で3〜7日間インキュベートします。溶液は 2 日ごとに交換してください(表 1)。

4. 免疫標識

注:標識ステップの前に、残留SDSを除去し、自家蛍光を低減し、10 mMトリス塩基、1 mM EDTA、および0.05% v/v Tween 20、pH 9からなる抗原賦活化溶液でエピトープをマスク解除する必要があります。溶液のpH 9 は、効率的な回収プロセスのために最適化されています。トリス塩基は緩衝剤として機能し、安定したpH環境を維持します。キレート剤であるEDTAは、抗原のアクセシビリティを高めます。非イオン性界面活性剤Tween 20は、組織の透過性を改善するのに役立ちます。この溶液は4°Cで保存できます。 過酸化水素と抗原賦活化ステップを組み合わせると、非特異的なバックグラウンドシグナルの原因となる内因性蛍光色素(リポフスチンなど)を分解および/または修飾することにより、自家蛍光シグナルを低減する相乗効果があることに注意することが重要です。

  1. 0.1% v/v Triton X-100(PBST)でPBSを1個調製し、37°Cに予熱し、インキュベーター内で37°Cで穏やかに振とうしながら、日中に3 x 3時間サンプルを洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。
    注:PBSTストック溶液は4°Cで保存してください。 SDSは低温で不溶性の沈殿物を形成し、その後の取得プロセスに干渉する可能性があるため、組織からSDSを除去することが重要です。
  2. 翌日、各サンプルに10 mLの30% v/v過酸化水素(H2O2)を加え、室温で45分間穏やかに振とうします。
  3. 室温で穏やかに振とうしながら、1x PBS(pH 7.4)で 3 x 10 分間洗浄します。
  4. 抗原賦活化溶液をウォーターバス中で95°Cに予熱します。サンプルを加熱した溶液に移し、95°Cで10分間放置します。
  5. 試験片を穏やかに振とうしながら40分間室温まで冷却します。
  6. 軽く振とうしながら、脱イオン水で3 x 5分間洗浄します。
  7. サンプルをPBS中で4°Cで15分間平衡化します。
  8. 0.01% w/v NaN3 のPBST製の新しい抗体溶液を調製し(ステップ1.3については注を参照)、一次抗体を添加します。サンプルをスクリュー蓋付きのディッシュに入れ、37°Cのインキュベーターで穏やかに振とうし、光から保護してn日間(1〜7)インキュベーターでインキュベートします(表2)。
    注:インキュベーション時間はサイズと厚さによって異なります(表1および表2)。
  9. n日後、サンプルをチューブに移し、インキュベーター内で穏やかに振とうしながら、37°Cで予熱したPBSTで3 x 2時間洗浄します。
  10. 0.01% w/v NaN3 のPBSTに二次抗体を添加し、サンプルをスクリュー蓋付きの新しいディッシュに入れ、37°Cでn日間(1-6)、穏やかに振とうし、光から保護したインキュベーターでインキュベートします(表1および表2)。
  11. n日後、サンプルをチューブに移し、穏やかに振とうするインキュベーターで37°Cに予熱したPBSTで日中に3 x 3時間洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。
    注意: Triton X-100およびTween 20は粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填してください。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。各サンプルに10 mLの抗体溶液を使用し、溶液の蒸発を防ぐためにパラフィルムでディッシュを密封します。抗体溶液にはNaN 3が含まれているため、 4°Cで保存し、2週間以内に新しい検体に再使用して標識することができます。

5. 屈折率マッチング

注:高いレベルの透明性を実現するには、組織の屈折率を均質化する必要があります。ここでは、1x PBSで希釈した2,2'-チオジエタノール(TDE)を使用します。TDE ソリューションは RT に保存する必要があります。

  1. サンプルを新しいディッシュに移し、30% v/v TDEを添加し、室温で穏やかに振とうしながら4時間放置します。
  2. 30% v/v TDE 溶液を除去し、68% v/v TDE をサンプルに添加し、室温で穏やかに振とうします。
    注意: TDEは粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填します。TDE蒸気またはミストを吸入すると、呼吸器系を刺激する可能性があります。したがって、曝露を最小限に抑えるために、換気の良い場所で作業するか、ドラフトを使用することをお勧めします。TDE 溶液は RT で保存する必要があります。 各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。

6. サンプルの取り付け

注:サンプルの取り付けとLSFM画像の取得を容易にするために、顕微鏡スライド、スペーサー、カバーガラスの3つの部分で構成されるカスタムメイドの密閉型サンプルホルダー(「サンドイッチ」と呼ばれる)を使用しています。

  1. スチールスペーサー(56 x 56 x 0.5 mm3)を顕微鏡スライド(60 x 60 x 1 mm3)の上に置き、サンプルを顕微鏡スライドに置きます。
  2. 石英カバーガラス(60 x 60 x 0.5 mm3)を慎重に置き、すべてをクリップで留め、1:1の比率で2成分のシリコン接着剤を準備します。屈折率を一致させるために石英カバーガラスを使用し、取得プロセス中の光学収差を低減します。
  3. 1 mLのシリンジを使用して、スペーサーとカバーガラスの間のスペースを2液シリコン接着剤で満たし、10分間乾燥させます。
  4. クリップを取り外し、小さな針を使用して、サンドイッチ全体を68%v/v TDEでゆっくりと満たします。
  5. 新鮮な接着剤を作り、サンドイッチを密封します。
    注意: 手順6.1でTDEが誤ってスペーサーに到達した場合、接着剤は硬化しません。手順6.2で気泡が発生しないことを確認してください。

7. ストリッピング

注:SHORTの構造保存とエピトープへのアクセス性の向上により、抗体を除去し、サンプルを他のマーカーで再染色することにより、スライスのマルチラウンドラベリングが可能になります。

  1. ブレードでサンドイッチを開き、30% v/v TDEで満たされたスクリュー蓋付きの新しい皿に試験片を入れ、3時間放置します。
  2. サンプルをチューブに移し、室温で1x PBS(pH 7.4)で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。
  3. サンプルを清澄溶液に浸し、80°Cのウォーターバスに4時間入れます。
  4. 1x PBST(pH 7.4)で37°C、穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。これで、サンプルをステップ4.8から再度ラベル付けする準備が整いました。
    注意: チューブには必ず50 mLの各溶液を充填してください。各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。

結果

ここで説明するプロトコルは、SHORT法を使用して、厚さ100μmから500μmの範囲の複数のスライスの同時処理を可能にします。このアプローチにより、手順全体の処理時間が大幅に短縮されます。この研究では、複数の死後ヒト脳厚切片を同時に処理するためのパイプライン全体(図1)を包括的に説明し、一度に24スライスのプロトコルを実証します(図2A...

ディスカッション

ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。

他のアプローチとは異...

開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

謝辞

マサチューセッツ総合病院、A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging、放射線科のBruce Fischl氏に、この研究で分析されたヒト脳標本を提供していただいたことに感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)のホライズン2020研究・イノベーションフレームワークプログラム(Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme)から助成金契約第654148号(Laserlab-Europe)、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation(研究・イノベーションのためのホライズン2020フレームワークプログラム)から特定助成契約第785907号(Human Brain Project SGA2)および第945539号(Human Brain Project SGA3)から、米国国立衛生研究所総合病院コーポレーションセンター(National Institutes of Health)から助成金U01 MH117023で資金提供を受けました。 Euro-Bioimaging Italian Node(ESFRI研究インフラストラクチャ)の枠組みにおけるイタリア教育省から。最後に、この研究は「Fondazione CR Firenze」の協力を得て行われました。この作業の内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

参考文献

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