大規模ヒト脳イメージングにおけるライトシート蛍光顕微鏡のための光学的透明化と標識

要約

現在のプロトコルは(Sの魔女- H₂O₂ -抗原 Retrieval - 2,2' -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。

要約

過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。

概要

ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。

プロトコル

ホルマリン固定ヒト組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院(MGH)剖検サービス(米国ボストン)の神経病理学部門から提供されました。Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC、プロトコル2003P001937)からIRBが承認した組織収集プロトコルに従って、死亡前に健康な参加者から書面による同意が得られました。承認文書は、米国マサチューセッツ州ボストンのMGH剖検サービスに保管されており、リクエストに応じて入手できます。

1. アガロース包埋とサンプル切断

1. ビーカー内の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中の4%w/vアガロース溶液を調製し、組織ブロックを内部に埋め込みます。室温(RT)に達するまで待ってから、4°Cで24時間保存します。
2. 高精度の切片を得るには、サンプルをビブラトームの検体ディスクに接着し、トレイに冷たい1x PBS(pH 7.4)を充填します。スライスする組織の種類に応じて、周波数、振幅、速度などのビブラトームパラメータを調整します(使用される値:周波数 = 5 (50 Hz)、振幅 = 0.4、速度 = 3 (0.15 mm/s)。
   注:サンプル量に応じて異なるビブラトームを使用する必要があります。最大容量が70 x 40 x 15 mmのサンプルには、ビブラトーム(Leica VT1000 Sなど)を使用できま....

ディスカッション

ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。

他のアプローチとは異.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200